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1研究目的流感病毒、结核杆菌等外来病原微生物被鼻腔吸入后可以经呼吸道感染机体,导致多种疾病,严重影响人类健康。相比于皮下注射型疫苗,采用鼻腔黏膜免疫制剂不仅可以避免穿刺导致的疼痛,还可以引起黏膜局部免疫应答,直接抵御微生物的入侵。然而,鼻腔生理环境在阻碍病原体进入体内的同时,也限制了灭活或减毒病毒抗原直接滴鼻对机体免疫应答的影响。因此,寻找和研发新型鼻黏膜疫苗佐剂在鼻腔免疫的研究与应用中占用重要地位。可德兰多糖(curdlan)是一种产碱杆菌发酵得到的β-1,3-葡聚糖,具有水不溶性。对其2’-OH和6’-OH进行硫酸化修饰得到的硫酸化可德兰多糖(curdlan sulfate,CS)不仅解决了可德兰多糖的溶解性问题,还具有抗氧化、抗HIV感染、免疫调节等生理活性。本课题组前期研究发现:CS可以与乙肝病毒相互作用,抑制病毒的入胞过程,从而具有抗HBV活性;CS特异性地与dectin-1受体结合,激活抗原递呈细胞(antigen-presenting cells,APCs)的MAPKs通路,促进细胞的成熟和细胞因子的产生,并直接诱导淋巴细胞的增殖活化;作为乙肝疫苗佐剂,可以提高HBsAg的免疫原性,引起机体体液免疫和细胞免疫水平的提升。因此,我们拟采用CS作为免疫刺激剂,期望提升抗原的免疫原性。为了提升抗原的有效递送,我们选择制备适合蛋白质透膜吸收的纳米载体。壳聚糖(chitosan)是目前发现的唯一的天然阳离子多糖,被广泛用于黏膜系统给药制剂。6-O-2’-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(6-O-2’-hydroxylpropyltrimethyl ammonium chloride chitosan,O-HTCC)是一种水溶性6-O-季铵化壳聚糖,由于6’-OH季铵化修饰提升了阳电荷密度,因此O-HTCC是良好的蛋白质抗原载体。利用CS和O-HTCC的电荷性质,我们制备了荷正电的CS/O-HTCC 纳米粒。本课题通过评价CS/O-HTCC纳米粒的抗原载体活性、滴鼻免疫有效性,对纳米粒的鼻黏膜疫苗佐剂应用可行性进行研究。之后,对纳米粒刺激免疫细胞和黏膜层的作用进行评价,以期探讨CS/O-HTCC纳米粒作为鼻黏膜疫苗佐剂的作用机制。2研究方法2.1 CS/O-HTCC纳米粒的制备及理化性质评价首先采用三氧化硫-吡啶体系对可德兰多糖进行硫酸化修饰,并采用苯甲醛-2,3-环氧丙基三甲基氯化铵体系对壳聚糖进行O-季铵化修饰,制备CS和O-HTCC。通过离子凝聚法获得CS/O-HTCC纳米粒,并利用粒径电位仪检测纳米粒的粒径、电位和多分散性,利用SDS-PAGE检测载蛋白质效率和体外释放。2.2 CS/O-HTCC纳米粒用作鼻黏膜免疫佐剂的体内评价卵清蛋白(ovalbumin,OVA)作为模式抗原吸附于CS/O-HTCC纳米粒,于第1、15、29天采用滴鼻免疫Balb/c小鼠,采用ELISA法检测免疫后小鼠血清和黏膜灌洗液中OVA特异性抗体的浓度,采用MTT法检测脾细胞的增殖和转化活性,中性红试剂法检测巨噬细胞的吞噬能力,流式细胞术对免疫细胞的表面标记进行检测。2.3 CS/O-HTCC纳米粒的免疫调节活性及其机制研究分离培养小鼠腹腔巨噬细胞,利用流式细胞术检测巨噬细胞的吞噬能力,利用共聚焦显微镜和透射电镜观察纳米粒在细胞中的分布,Western blot检测iNOS和Cox-2蛋白表达水平,RT-PCR检测iNOS、Cox-2、IL-1β、IL-6和TNF-α的转录水平,Griess试剂法检测NO的含量,ELISA法检测IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。分离培养小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow dendritic cells,BMDCs),利用流式细胞术检测BMDCs的表面标记,利用RT-PCR技术检测CXCL-10、IFNAR1、IFNAR2和IFN-β的转录水平,ELISA法检测IL-6和IL-12的含量,对BMDCs/淋巴细胞共培养体系中IFN-γ+淋巴细胞进行检测评价BMDCs的功能性活化。分离小鼠脾细胞,利用CCK-8法检测淋巴细胞的增殖能力,Western blot检测增殖相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达水平,RT-PCR检测CTLA-4、IL-2和TGF-β的转录水平。2.4 CS/O-HTCC纳米粒的透膜转运活性及其机制研究利用Calu-3细胞系构建体外鼻黏膜模型,采用CCK-8法检测纳米粒细胞毒性,采用荧光显微镜和流式细胞术检测纳米粒被上皮细胞摄取的能力,荧光酶标仪检测纳米粒对抗原透黏膜能力的影响。内吞机制研究:采用盐酸氯丙嗪、染料木黄酮和细胞松弛素D刺激上皮细胞,利用流式细胞术检测纳米粒对于抗原内吞的影响。细胞旁途径转运机制研究:Western blot检测紧密连接相关蛋白和粘着连接相关蛋白的表达。淋巴转运机制研究:构建Calu-3/DCs共培养体系,通过流式细胞术检测黏膜下DCs的表型活化;Balb/c小鼠滴鼻给药后,采用ELISA法检测不同时间点颈部淋巴结中抗原含量,采用荧光显微镜观察给药2h后颈部淋巴结切片中抗原分布,采用免疫荧光染色法检测颈部淋巴结APCs中抗原的含量。3研究结果3.1 CS/O-HTCC纳米粒的制备及评价制备得到硫酸化程度为13.74%的CS和季铵化程度为30.22%的O-HTCC。按照1:5的浓度比,滴加制备得到粒径167.03±5.88 nm,电位50.10±0.85 mV,分散度均一(PDI=0.12±0.01)的CS/O-HTCC纳米粒。OVA可以吸附至CS/O-HTCC纳米粒上,加入比例为4:1:5。该纳米粒装载OVA的效率较高(72.60%±2.21%),在pH 7.4的生理条件下,具有缓释效果。3.2 OVA/CS/O-HTCC纳米粒滴鼻免疫提升小鼠系统免疫应答和局部黏膜免疫应答水平相比于抗原单独免疫,CS/O-HTCC纳米粒作为鼻黏膜疫苗佐剂可以显著提升鼻腔免疫后小鼠巨噬细胞的增殖(###p<0.001)和吞噬能力(###p<0.001)。促进APCs在脾脏中的募集和表型活化。相比于OVA滴鼻组,采用荷载OVA的CS/O-HTCC纳米粒滴鼻免疫小鼠后,脾细胞的增殖和转化活性均有显著性提高(###p<0.001,###p<0.001);CS和O-HTCC作为疫苗佐剂,可以促进脾脏中CD3+CD4+T细胞(*p<0.05,**p<0.01)和CD3+CD8+T细胞(*p<0.05,*p<0.05)的聚集,但对于Th细胞的活化并无明显作用(p>0.05)。OVA/CS/O-HTCC纳米粒滴鼻后,脾脏中CD4+T细胞(***p<0.001)和CD8+T细胞(**p<0.01)数量增长更为显著,并能显著性活化CD4+T 细胞(**p<0.01)。OVA/CS/O-HTCC纳米粒滴鼻免疫后,小鼠血清中OVA特异性IgG及其亚型IgG1、IgG2a和IgA的抗体滴度显著提升,由OVA引起的IgG1/IgG2a偏差明显被纠正(##p<0.01)。通过对Th1型和Th2型细胞因子含量检测,也证实相比于OVA滴鼻组,OVA/CS/O-HTCC纳米粒滴鼻后可以诱导IFN-γ的分泌(#p<0.05),使免疫类型向Th1型转变。通过对黏膜灌洗液中sIgA的检测,证实CS/O-HTCC纳米粒作为鼻黏膜疫苗佐剂可以明显刺激机体产生近端黏膜免疫(###<0.001)及远端黏膜免疫应答(###p<0.001)。综上所述,CS/O-HTCC纳米粒作为鼻黏膜疫苗佐剂可以增强抗原的免疫原性,改变抗原的免疫类型,纠正由OVA引起的Th2型偏向,提升机体的系统免疫和黏膜免疫应答。3.3 CS/O-HTCC纳米粒多效性地刺激抗原递呈细胞的活化对于巨噬细胞:①CS/O-HTCC纳米粒刺激巨噬细胞后不仅可以显著提高细胞吞噬能力(***p<0.001),还可以帮助荷载的抗原被有效摄取。该活性主要依赖于O-HTCC的活性。②通过观察抗原被摄取后的亚细胞定位,发现CS/O-HTCC纳米粒携带的抗原被巨噬细胞吞噬后会发生溶酶体逃逸。该作用可能与CS/O-HTCC纳米粒的酸敏感性有关。③CS/O-HTCC纳米粒可以显著性提升多种炎性因子的转录、表达和分泌。该作用主要依赖于CS的活性。对于树突状细胞:①CS/O-HTCC纳米粒刺激BMDCs后可以显著性提升CD40、CD80和CD86分子的阳性表达,说明纳米粒可以引起树突状细胞的表型活化。②CS/O-HTCC纳米粒刺激后DCs与淋巴细胞共孵育,可以显著提升淋巴细胞中IFN-γ的阳性表达(***p<0.001)。说明纳米粒可以诱导树突状细胞的功能性活化。③CS/O-HTCC纳米粒在活化MHC Ⅱ分子的同时,显著性刺激BMDCs表面MHC I分子的阳性表达,预示CS/O-HTCC纳米粒可以刺激树突状细胞发生交叉递呈。该作用主要依赖于O-HTCC的活性。④CS/O-HTCC纳米粒可以显著性提升I型干扰素相关基因的转录。该作用依赖于O-HTCC的活性。⑤CS/O-HTCC纳米粒刺激BMDCs后诱导IL-6和IL-12的高水平分泌(***p<0.001,***p<0.001)。该作用主要依赖于CS的活性。3.4 CS/O-HTCC纳米粒通过多途径刺激淋巴细胞的增殖活性CS/O-HTCC纳米粒直接刺激淋巴细胞,刺激IL-2的转录,下调CTLA-4和TGF-β的转录水平;不同程度上调p-AKT、p-ERK、p-JNK的蛋白表达,引起NF-κB的磷酸化活化;抑制促凋亡蛋白Bax的表达,提升抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,从而抑制Caspase-3的切割活化;最终显著性提升淋巴细胞的生长率(*p<0.05)。3.5 CS/O-HTCC纳米粒可帮助抗原透鼻黏膜和被树突状细胞摄取CS/O-HTCC纳米粒在不同浓度下均未影响上皮细胞的生长,表明纳米粒对鼻黏膜无明显毒性。CS/O-HTCC纳米粒携带抗原不仅可以被上皮细胞摄取(*p<0.05),还可以有效透过致密的鼻黏膜层(***p<0.001)。对其透膜机制研究发现:CS/O-HTCC纳米粒可以显著性抑制TJP 1、OCLN、p-Claudin 4 和 CDH 1 的表达(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,***p<0.001),从而打开细胞间的紧密连接和粘着连接;盐酸氯丙嗪、染料木黄酮和细胞松弛素D可以显著性抑制FITC-OVA/CS/O-HTCC纳米粒被上皮细胞的内吞(***p<0.001,***p<0.001,***p<0.001),证实CS/O-HTCC纳米粒可以帮助抗原通过网格蛋白介导的内吞、小窝蛋白介导的内吞和巨胞饮作用进入上皮细胞。成功穿膜后,CS/O-HTCC纳米粒可以刺激黏膜下APCs的表型活化。通过检测滴鼻后不同时间点颈部淋巴结中OVA的含量,我们发现CS/O-HTCC纳米粒可以明显增加抗原进入淋巴结的含量并延长其作用时间,并且在2 h时淋巴结中抗原含量达到顶峰。通过免疫荧光实验我们发现,FITC-OVA直接滴鼻,颈部淋巴结中的荧光信号微弱;而FITC-OVA/CS/O-HTCC纳米粒滴鼻2h后,巨噬细胞和树突状细胞可以携带被摄取的抗原进入颈部淋巴结的深处,且荧光强度明显提高。4创新性和结论(1)首次采用离子凝聚法制备得到大小均一、荷正电的CS/O-HTCC纳米粒,并证实了其具有蛋白类抗原载体的活性。制备工艺简单经济、绿色环保。(2)首次评价了 CS/O-HTCC纳米粒的鼻黏膜疫苗佐剂活性。滴鼻免疫后,CS/O-HTCC纳米粒可以提高装载抗原的免疫原性,改变抗原的免疫类型,有效活化免疫细胞,促进血清和黏膜灌洗液中抗原特异性抗体的产生,增强机体的系统免疫和黏膜免疫水平。(3)首次对CS/O-HTCC纳米粒的免疫调节活性进行评价,证实CS/O-HTCC纳米粒可以多效性地刺激巨噬细胞、树突状细胞的活化和成熟,直接刺激淋巴细胞的增殖。(4)首次对CS/O-HTCC纳米粒的透膜转运能力进行研究,证实CS/O-HTCC纳米粒可以促进抗原通过网格蛋白介导的内吞、小窝蛋白介导的内吞和巨胞饮作用进入鼻黏膜上皮细胞,同时通过打开黏膜上皮细胞间的紧密连接和粘着连接跨过致密的鼻黏膜屏障,并被黏膜下APCs摄取后转运至颈部引流淋巴结中引发进一步的免疫应答。