目前,国内在酒酒球菌分类鉴定方面的研究还很少。本研究通过对我国葡萄酒主产区筛选的22株酒酒球菌进行鉴定和SE-AFLP分析,对酒酒球菌鉴定和遗传多样性研究的方法进行了探索,建立了一套快速、有效的反应体系,主要结果如下:1.酒酒球菌的快速特异性PCR鉴定和鉴定体系的优化本研究采用了目前普遍使用的酒酒球菌快速鉴定方法—species-specific PCR技术对我国葡萄酒主产区筛选的22株酒酒球菌进行了鉴定。优化了DNA提取方法,使用优化后的溶菌酶法提取的DNA不需要纯化可以直接用于扩增,实现快速鉴定,扩增结果稳定。进一步通过优化反应体系和反应条件,实现菌液和菌落直接作为模板进行扩增,扩增结果清晰、稳定,大大简化了操作过程,提高了鉴定的效率和稳定性。反应体系为(20μL):10×PCR buffer 2.0μL,dNTP 1.6μL (2.5 mmol/L),Mg2+ 1.6μL(25 mmol/L),上下游引物各0.8μL(10μmol/L),菌液2.0μL(对数期)或者用灭菌牙签蘸取菌落少许,Taq酶0.1μL(5 U/μL)。反应条件为:94℃预变性5 min,94℃变性45s,64℃退火2 min,72℃延伸2 min,35个循环。最后72℃延伸10 min。2.为进一步鉴定各菌株及验证species-specific PCR技术的可靠性,对菌株16S rRNA基因序列进行了分析测定了22株细菌16S rRNA基因的41-705位之间的序列,与GeneBank数据库里酒酒球菌模式菌株的序列进行比对,比对结果显示,22株菌与模式菌株的16S rRNA基因序列的相似性都在99.8 %以上。进一步验证了species-specific PCR鉴定技术的可靠性。对22株菌和模式菌的16S rRNA基因序列进行多序列比对分析,结果显示:它们之间的序列相似性都在99.8 %以上,说明酒酒球菌16S rRNA基因比较保守。调取链球菌科7个属的模式菌的16S rRNA基因序列与22株酒酒球菌的相应序列一起构建系统进化树,结果表明: Oenococcus oeni、Leuconostoc mesenteroides、Weissella viridescens为一个类群,亲缘关系较近,其中Leuconostoc mesenteroides与Oenococcus oeni亲缘关系最近。3.为了研究酒酒球菌的遗传多样性,建立了酒酒球菌的SE-AFLP反应体系在利用SE-AFLP技术研究酒酒球菌遗传多样性过程中,从酶切连接、扩增条件等方面进行优化,建立了酒酒球菌SE-AFLP分析的最适反应体系为:10μL(200 ng) DNA用3U HindⅢ于37℃温浴12 h酶切,22℃下连接12 h;扩增时取稀释5倍后的连接产物5μL,HindⅢ引物0.75μL(10μmol/L),Taq酶0.2μL (5 U/μL),10×PCR buffer 2.5μL,dNTP 1μL(2.5 mM),MgC12 2μL(25 mM) ,ddH2O补至25μL,进行扩增。在此优化体系下,可以得到重复性好、多态性高的酒酒球菌SE-AFLP条带。4、利用SE-AFLP分子标记技术研究酒酒球菌的遗传多样性用带一个选择性碱基的四条引物对酒酒球菌基因进行SE-AFLP分析,检测结果显示:每条引物在个体间扩增条带的数目在16-23条之间,平均每条引物扩增19.5个条带。在总共检测出的78个位点中,多态性位点有49个,多态性比率为62.82%。相似性分析结果显示:不同菌株之间遗传相似性系数相差较大。聚类分析结果表明在遗传相似性系数GS=0.690时可将22株酒酒球菌分为两大类群。这些研究结果表明我国葡萄酒主产区筛选的22株酒酒球菌具有较丰富的遗传多样性。利用选择的四条引物产生的SE-AFLP条带可以将这22株酒酒球菌完全区分开。SE-AFLP分子标记技术可以作为酒酒球菌菌株间区分的方法。