【摘 要】
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目的:本实验基于络病学理论,从体外探究以“补、清、消肾络”法为立法组方的芪蓟肾康汤含药血清通过p38-p53-p21通路对血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球系膜细胞增殖的影响,进一步论证芪蓟肾康汤防治IgAN的富集通路和机制,揭示“肾络病”理论治疗IgAN的科学内涵。材料与方法:1.“补、清、消肾络”立法组方含药血清制备:将40只SD级雄性大鼠随机分为5组,每组8只,分别为正常组（生理盐水）、西药组（替米沙
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目,项目名为“补、清、消肾络”法通过ERK和TGF-β1/Smads信号转导通路调控IgA肾病的机制研究（NO.81673956）
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目的:本实验基于络病学理论,从体外探究以“补、清、消肾络”法为立法组方的芪蓟肾康汤含药血清通过p38-p53-p21通路对血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球系膜细胞增殖的影响,进一步论证芪蓟肾康汤防治IgAN的富集通路和机制,揭示“肾络病”理论治疗IgAN的科学内涵。材料与方法:1.“补、清、消肾络”立法组方含药血清制备:将40只SD级雄性大鼠随机分为5组,每组8只,分别为正常组（生理盐水）、西药组（替米沙坦）、中药低剂量组（低剂量芪蓟肾康汤）、中药中剂量组（中剂量芪蓟肾康汤）、中药高剂量组（高剂量芪蓟肾康汤）。大鼠经适应性喂养3天后,连续灌胃辽宁中医药大学附属医院中药局煎药室制备的芪蓟肾康汤剂7天,末次给药1h后无菌条件下腹主动脉采血并经离心机离心,上清液经水浴灭活、过滤除菌后-20℃保存备用。2.人肾小球系膜细胞体外培养及分组:液氮中取出人肾小球系膜细胞接种于75cm~2培养瓶,在培养瓶中加入10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,于恒温37℃、5%CO2培养箱中培养,每两天换液一次。应用血管紧张素Ⅱ作为刺激因子使人肾小球系膜细胞增殖,对细胞进行分组处理,使用药理血清对其干预,分别为空白组、模型组(10-7mol/L血管紧张素Ⅱ)、西药组(10-7mol/L血管紧张素Ⅱ+6.25mg·kg-1替米沙坦)、中药低剂量组(10-7mol/L血管紧张素Ⅱ+11.8mg·g-1芪蓟肾康汤)、中药中剂量组(10-7mol/L血管紧张素Ⅱ+23.6mg·g-1芪蓟肾康汤)、中药高剂量组(10-7mol/L血管紧张素Ⅱ+47.2mg·g-1芪蓟肾康汤)。3.检测方法:MTT法检测48h各组人肾小球系膜细胞增殖情况;实时荧光定量PCR法检测血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小球系膜细胞CTGF、p38MAPK、p53、p21m RNA相对表达水平;酶联免疫吸附法（Elisa）检测血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小球系膜细胞CTGF、p38MAPK、P-p38MAPK含量。结果:1.MTT法结果显示:与空白组对比,模型组人肾小球系膜细胞增殖情况最为明显,有统计学差异（p＜0.01）;与模型组对比,中药高剂量组增殖抑制效果最为明显（p＜0.01）。2.实时荧光定量PCR法结果显示:与空白组对比,模型组CTGF、p38MAPKm RNA表达水平显著增加（p＜0.01）,p53、p21m RNA表达水平显著降低（p＜0.01）;通过含药血清干预后,与模型组对比,中药组能明显调节改善AngⅡ诱导后人肾小球系膜细胞中以上各指标的m RNA表达水平（p＜0.01或p＜0.05）。3.酶联免疫吸附法结果显示:与空白组对比,模型组CTGF、p38MAPK、P-p38MAPK蛋白的含量升高（p＜0.01）;与模型组对比,中药组以上蛋白含量显著降低,且差异有统计学意义（p＜0.01）;与西药组对比,中药高剂量组P-p38MAPK蛋白含量明显低于西药组（p＜0.05）。结论:1.“补、清、消肾络”立法组方对血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小球系膜细胞增殖具有明显抑制作用,作用靶点可能为CTGF、p38MAPK、p53、p21蛋白。2.“补、清、消肾络”立法组方减缓系膜增生的机制可能为干预p38-p53-p21信号通路相关蛋白的表达,进而抑制p38MAPK磷酸化,减少CTGF的表达,调控p53、p21蛋白,改变细胞周期,促进增殖细胞凋亡,最终达到防治IgAN目的。3.论证了“补、清、消肾络”法对于IgAN的作用机制,为“肾络病”理论治疗IgAN提供理论与实验支撑。
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