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本课题组前期从汕头南澳海域的一株紫菜藻体上分离到一株高效琼胶降解菌株Aquimarina agarilytica ZC1,并完成了该菌的全基因组测序,BLAST结果显示该菌具有40个可能的琼胶酶基因,其中有18个属于GH16家族,11个属于GH86家族,3个属于GH50家族,1个属于GH117家族,其余7个未搜索到GH家族保守区。 通过构建琼胶酶氨基酸序列的系统进化树,发现其中琼胶酶573、575和576属于糖苷水解酶GH50家族,琼胶酶基因573包含2325bp,编码774个氨基酸,预测其分子量为87.9KDa,等电点为7.35;琼胶酶基因575包含2085bp,编码694个氨基酸,预测其分子量为78.6KDa,等电点为8.38;琼胶酶基因576包含2139bp,编码712个氨基酸,预测其分子量为81.4KDa,等电点为7.05。使用pET-32a(+)载体构建基因的表达载体,将重组质粒转入表达宿主Escherichia coli Rosetta(DE3)中,成功构建重组表达工程菌,终浓度为0.1mM的IPTG,16℃诱导24h。通过SDS-PAGE及Western-blotting证实了重组酶在宿主中的大量表达。通过镍柱亲和层析纯化得到重组琼胶酶573、575和576,并达到了电泳纯。通过DNS法测定琼胶酶活性发现,仅重组酶575和576具有琼胶酶活性,而重组酶573没有琼胶酶活性。通过对琼胶酶催化模块基因C573、C575和C576进行克隆和重组表达,发现保守区基因的表达产物均不具有琼胶酶的活性,并且没有表现出对琼脂糖的绑定作用。 对重组酶的酶学性质研究发现:重组酶575在温度为37℃~40℃之间以及在pH为6.0~10.0之间具有较高的酶活力,其中在温度为37℃、pH为8.0时酶活力最高,同时该酶在温度小于40℃以及pH在5.0~10.0之间表现稳定。金属离子Ca2+对575酶活性有很强的促进作用,在浓度为50mM的条件下琼胶酶575的活力提高了136%;重金属离子 Al3+以及 EDTA-Na2、SDS会抑制琼胶酶575的活性。其降解琼脂糖的Vmax和Km值分别为8.27×10-5mol·L-1·min-1和0.0133mol·L-1。重组酶576在温度为37℃、pH为6.0时酶活力最高;尿素、EDTA-Na2和金属离子Na+、K+、Fe3+对重组酶576活性几乎没有影响;SDS和金属离子 Mg2+、Ca2+、Al3+严重抑制重组酶576的活性;其降解琼脂糖的Vmax和Km值分别为6.22×10-5mol·L-1·min-1, Km值为0.0132mol·L-1。 采用13C-NMR对重组琼胶酶降解琼脂糖终产物进行进一步的分析,图谱显示位于97ppm与93ppm处存在响应峰,而90.7ppm处无共振响应,由此确定重组酶为β-琼胶酶。通过TLC对重组酶575和576降解琼脂糖和新琼寡糖产物进行分析,其终产物是新琼二糖。最终我们得出结论:重组酶575和576均属于GH50家族,为外切型的β-琼胶酶,二者降解琼脂糖和新琼寡糖的唯一产物均是新琼二糖,这在国际上鲜有报道。 通过系统进化树发现,琼胶酶852与GH117家族的α-新琼二糖水解酶相似性很高,将重组酶852与已经报道的新琼寡糖水解酶进行氨基酸序列比对,该酶852具有 GH117家族的催化活性部位的保守氨基酸。通过对该基因进行克隆和表达,进一步验证了852属于GH117家族的一个成员,并且能够将新琼二糖降解为β-D-半乳糖和3,6-酐-α-L-半乳糖。