目的:胰腺癌是世界范围内最难以治疗的恶性肿瘤之一。胰腺癌患者5年生存率仍不到6％，由于其恶性程度较高，患者发现时往往处于晚期，只有少于20％的患者具有手术指征。传统的手术联合放化疗方法效果并不理想，并且较易在根治性手术切除后复发。近年来，研究人员不断开发新的治疗方法，除了新的抗癌药物和分子靶向治疗外，免疫治疗有望成为未来治疗胰腺癌的新的有效方法。程序性死亡分子-1(programmed death1，PD-1)/PD-1配体1(PD-1 ligand1，PD-L1)信号通路由于对癌症的免疫调节、预后价值和治疗潜力的重要作用，越来越成为研究的热点。　　PD-1是免疫球蛋白CD28超家族成员之一。PD-1诱导T细胞、B细胞和单核细胞的活化，对外周免疫耐受和自身免疫起着重要作用。PD-1具有两个配体分子:PD-L1和PD-L2，两者通过与PD-1受体结合抑制细胞和体液免疫应答。PD-L1表达在非活化的T细胞、B细胞、肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞表面上，同时也在多种肿瘤中表达，且与肿瘤免疫逃逸关系密切。越来越多的研究表明，PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤免疫应答过程中扮演重要的角色，PD-1与PD-L1相护结合能够抑制T细胞受体信号通路，诱导效应T细胞的凋亡及肿瘤浸润性调节T细胞(regulatoryT cell，Treg)的增殖，进而促进肿瘤的生长和侵袭。在多种恶性肿瘤的研究中表明，PD-L1的表达水平与肿瘤浸润淋巴细胞的数量呈负相关。此外，Treg被证明在阻碍免疫监视和有效的抗肿瘤免疫应答中扮演重要的角色。PD-1/PD-L1信号通路能够促进FOXP3+调节性T细胞的增殖，抑制T细胞活化，促进肿瘤的生长和转移。　　在多项恶性肿瘤研究中表明PD-L1表达水平增加与抑癌基因(phosphatase andtensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)的缺失显著相关。PD-1/PD-L1信号通路通过募集SHP2进而磷酸化PI3K，同时降低PTEN活性，这一系列的反应导致了PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活。PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化调节多种人类肿瘤细胞的增殖和活化，对肿瘤的侵袭转移起到重要作用。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是Zn离子依赖的蛋白水解酶超家族，其中MMP2和MMP9蛋白能够特异性的降解ECM的蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭能力的作用，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。PI3K/Akt/mTOR信号通路可以调节MMPs的表达。　　为此，本研究进一步探究PD-L1表达水平与FOXP3+ Treg、 CD4+T和CD8+T细胞浸润程度的关系，及PD-L1表达与FOXP3+ Treg对胰腺癌患者的病理分期及生存预后的影响。同时建立原位胰腺肿瘤动物模型，探究了PD-L1阻断剂对胰腺癌及其转移瘤的治疗效果，分析PD-L1的表达与PTEN缺失的关系，随后探究PD-L1阻断剂如何影响PI3K/Akt/mTOR信号通路及下游信号分子MMP2和MMP9的表达，从而抑制胰腺癌的发展及胰腺癌肝脏转移瘤的发生。我们的研究结果能够更加深入地探究PD-L1阻断剂影响胰腺癌的生长和转移的作用机制。　　研究方法:(1)我们通过大样本胰腺癌标本，评估PD-L1表达水平与患者预后和免疫细胞浸润程度之间的关系。人胰腺癌组织芯包含63例胰腺癌患者手术标本。通过免疫组化法检测标本中PD-L1，CD4，CD8和FOXP3的表达水平。每个肿瘤位点在高倍镜视野下选取5个不重叠的区域进行评估，每个高倍镜视野下至少计数200个肿瘤细胞。对于PD-L1染色的分析，PD-L1表达阳性的肿瘤细胞率≥10％为PD-L1表达阳性，＜10％为PD-L1表达阴性。对于CD4和CD8染色的评估，每高倍镜视野下≥150个CD4+T细胞为浸润阳性，＜150个CD4+T细胞为浸润阴性;每高倍镜视野下≥100个CD8+T细胞为浸润阳性，＜100个CD8+T细胞为浸润阴性。对于FOXP3的评估，阳性区域面积占总面积比＜10％的为FOXP3表达阴性，阳性区域面积占总面积比≥10％的为FOXP3表达阳性。分析PD-L1表达与FOXP3+ Treg之间的关系，以及两者与患者年龄、性别、原发灶肿瘤生长、淋巴结转移、远处器官转移及TNM病理分期之间的关系。同时，分析PD-L1表达与CD4+和CD8+T细胞浸润之间的关系。　　(2)我们通过建立小鼠原位胰腺癌模型，探究抗PD-L1抗体抑制肿瘤生长、侵袭及转移的作用机制的研究。我们将小鼠胰腺癌Panc02细胞注射于雌性C57BL/6小鼠胰尾部建立小鼠原位胰腺癌模型，建瘤成功后对小鼠进行随机分组。治疗组给予小鼠Anti-PD-L1抗体，对照组给予相同剂量的生理盐水，给药次数均为3次/周，共5周。种瘤7周后处死小鼠，观察小鼠胰腺肿瘤生长、侵袭及转移情况。收集的小鼠胰腺肿瘤及肝脏转移瘤标本，免疫组化染色检测PD-L1、CD4及CD8表达水平，RT-PCR检测PTEN、PI3K、Akt、mTOR、MMP2及MMP9的mRNA表达水平，Western Blot检测PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、MMP2及MMP9的蛋白表达水平。　　(3)数据采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计数资料均表示以平均数±标准差。患者总生存率用Kaplan-Meier法的对数秩检验来评估。Spearmans等级相关检验用来评估PD-L1表达和Foxp3+ Treg浸润与临床病理特征之间的关系。Students t检验用来比较实验组与对照组肿瘤大小、PD-L1表达水平、PI3K/Akt/mTOR信号通路及其下游分子MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表达水平间的差异。单因素和多因素分析均基于Cox比例风险回归模型进行。所有检验均为双侧，P＜0.05表示差异有统计学意义。　　结果:(1)在63例胰腺癌患者中，年龄＜65岁17例(27％)，≥65岁46例(73％);男性41例(65.1％)，女性22例(34.9％)，平均年龄为65.52±9.51岁（41-85岁）。随访时间从2009年7月至2014年11月，其中死亡50例，生存13例，平均生存期为21.8±19.4月（1-65月）。患者全部为原发性胰腺癌，术前4例患者伴有肝转移，5例患者伴有肠系膜转移，其他患者未发现其他部位转移。术中见肿瘤部位:胰头部46例，胰体尾16例，胰尾部1例。胰腺肿瘤病理分型为:胰腺导管腺癌52例，胰腺导管腺癌+部分粘液腺癌6例，胰腺导管腺癌+部分鳞状细胞癌4例，胰腺低分化腺癌1例。有淋巴结转移者37例，无淋巴结转移者26例。免疫组化分析发现26(41.3％)例患者PD-L1表达阳性，37(58.7％)例患者PD-L1表达阴性;28(44.4％)例患者有较高水平的FOXP+ Treg细胞浸润，35(55.6％)例患者有较低水平的FOXP3十Treg细胞浸润;22(34.9％)例患者PD-L1表达阳性且伴有较高水平的FOXP3+ Treg细胞浸润，20(31.7％)例患者PD-L1表达阴性且伴有较低水平的FOXP3+ Treg细胞浸润，6(9.6％)例患者PD-L1表达阳性且伴有较低水平的FOXP3+Treg细胞浸润，15(23.8％)例患者PD-L1表达阴性且伴有较高水平的FOXP3+ Treg细胞浸润。Spearmans相关分析发现胰腺癌患者中PD-L1表达水平和FOXP3+ Treg细胞浸润之间呈明显相关。PD-L1表达阳性同时伴有较高FOXP3+ Treg细胞浸润的患者显示最差的预后情况，表现为生存时间明显减少;PD-L1表达阴性同时伴有较低FOXP3+ Treg细胞浸润的患者显示最好的预后情况，表现为生存时间明显延长。PD-L1表达和FOXP3+ Treg细胞浸润与患者年龄和性别不相关，与肿瘤原发灶生长的情况T，区域淋巴结受累的情况N，远处转移情况M，及肿瘤TNM病理分期明显相关。PD-L1表达与肿瘤浸润CD4+和CD8+T淋巴细胞呈明显负相关，尤其是CD8+T淋巴细胞。　　(2)小鼠血清CA19-9水平在建瘤7天后与建瘤前相比明显上升，证明建瘤成功。Anti-PD-L1抗体治疗组的小鼠与对照组相比体重无明显变化，平均胰腺瘤重明显下降，发生胰腺癌肝转移率明显下降。免疫组化结果显示，Anti-PD-L1抗体治疗组的小鼠胰腺癌及其肝脏转移瘤上的PD-L1表达水平明显降低，CD4+T和CD8+T细胞的浸润水平明显升高。Anti-PD-L1抗体治疗组小鼠胰腺肿瘤及其肝转移瘤中PTEN的mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组，p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平明显低于对照组。同时，Anti-PD-L1抗体治疗后小鼠胰腺肿瘤及其肝转移瘤组织中的MMP2和MMP9相对mRNA和蛋白表达水平均有明显下降。　　结论:我们的研究首次表明，PD-L1和FOXP3表达水平是人类胰腺癌预后的新型标志。PD-L1表达水平与FOXP3十Treg细胞浸润情况显著相关。PD-L1表达水平和FOXP3+Treg细胞浸润情况与术后预后呈显著负相关，且PD-L1表达水平和FOXP3+Treg浸润情况与胰腺癌肿瘤生长情况，淋巴结转移情况，远处器官的转移情况及TNM分期显著相关。此外，PD-L1表达水平与TILs浸润呈负相关。PD-L1阻断剂在小鼠体内降低了PD-L1在胰腺癌上的表达，增加了CD4+T和CD8+T细胞的浸润水平，阻断了PD-1/PD-L1信号通路的启动，同时阻止了PTEN的缺失，进而对PI3K/Akt/mTOR信号通路产生影响。我们的结果还证明了，PD-L1阻断剂能够通过影响PI3K/Akt/mTOR信号通路，进而下调MMP2和MMP9的表达和活性。这些体内研究结果表明，PD-L1阻断剂在胰腺癌的治疗中有抗肿瘤和抗转移的作用，PD-L1是胰腺肿瘤生长、侵袭和转移的关键调节点。为更深入地研究胰腺癌的免疫治疗打下了坚实的理论与实验基础。