研究背景及目的:结直肠癌是世界范围内常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率与死亡率分别居于恶性肿瘤中的第三位和第二位。在我国,结直肠癌的发病率与死亡率都居于恶性肿瘤的第四位,并且随着环境与人们生活方式的转变,其发病率呈逐渐上涨的趋势。由于人们对结直肠癌的发病机制了解的不够清楚,结直肠癌的治疗一直没有取得重大的突破。因此,深入研究结直肠癌发生发展的分子机制,寻找新的结直肠癌分子标志物和治疗靶点,对结直肠癌的早期诊断、临床治疗及预后有着重大的意义。Hedgehog（Hh）信号通路是广泛分布、进化保守的信号通路。该通路在胚胎的发育、组织器官的形成以及机体稳态的维持中都具有着重要的作用。此外,Hh信号通路的异常激活与多种肿瘤的发生发展密切相关,其中包括:基底细胞癌、髓母细胞瘤、胃癌、结直肠癌、肝癌以及前列腺癌等恶性肿瘤。虽然,Hh信号通路在肿瘤生长过程中的作用与机制的研究已经取得一些进展。但由于肿瘤的异质性以及不同阶段的差异性,Hh信号通路在肿瘤发生发展中的作用与机制仍需进一步明晰。近年来,研究表明Hh信号通路的异常激活与结直肠癌的发生发展具有紧密联系。但是Hh信号通路的异常激活在结直肠癌发生发展中的具体作用及机制仍不清楚,以及结直肠癌中Hh信号通路异常激活的分子机制也不清楚。因此,为了研究Hh信号通路在结直肠癌生长过程中的作用,我们通过检测Hh信号通路抑制剂处理的结直肠癌细胞中表达谱的改变,筛选差异表达的基因,并选择功能未知的蛋白SNEP1（SuFu negating protein 1）进行后续的研究,用以阐明Hh信号通路异常激活在结直肠癌发生发展中的作用及分子机制。研究方法与结果:第一部分:SNEP1:一个Hedgehog信号通路新下游靶基因方法:1、利用Hh信号通路的上下游抑制剂环靶明（cyclopamine）和Gant61分别处理结直肠癌细胞系HT-29细胞,然后通过基因表达谱芯片检测表达谱差异。2、选取SNEP1作为Hedgehog信号通路的新下游靶基因候选,利用Shh配体、环靶明和Gant61分别处理HT-29或Caco2细胞,通过Real-time PCR技术和Western blot技术验证。3、通过过表达或干扰转录因子Gli2,检测SNEP1表达水平的变化,研究SNEP1是否受Gli2的调控。4、通过Genomatics（http://www.genomatix.de/）进行转录因子结合序列分析SNEP1基因的启动子区Gli2的结合位点。通过染色质免疫共沉淀（ChIP）予以验证。5、将验证过的结合位点所在区域的序列整体克隆插入荧光素酶报告质粒pGL3.0-SNEP1-Luci。并用这个质粒做删除突变,依次删除各结合位点,通过双荧光素酶报告系统验证这些结合位点是否受Gli2的调控。结果:1、通过结肠癌细胞HT-29细胞表达谱差异聚类分析发现,环靶明和Gant61处理都具有表达差异的基因41个,其中SNEP1在两种处理中都显著下调。2、通过Real-time PCR和Western blot验证,在Shh配体刺激下SNEP1表达上调,在环靶明和Gant61处理下SNEP1表达都下调。3、过表达Gli2能促进SNEP1表达上调,干扰Gli2能促进SNEP1表达下调。4、通过软件分析预测发现SNEP1启动子区有3个Gli2的结合位点（BS1,BS2,BS3）,同时染色质免疫共沉淀也验证了 Gli2能与这三个位点直接结合。5、双荧光素酶报告系统结果显示,Gli2能够激活含有三个结合位点的启动子区域的表达。通过删除突变发现BS1为主要的激活位点,BS2能够增强启动子活性,而BS3却减弱了前面两个位点的启动活性。第二部分:SNEP1通过激活Hedgehog信号通路促进结直肠癌细胞增殖方法:1、在HEK293T细胞中过表达SNEP1,通过Western blot技术检测Hh信号通路重要成员及下游靶基因（Gli2、SuFu、Bcl2）的蛋白水平的变化,验证SNEP1是否能反馈调节Hh信号通路。2、利用过表达SNEP1的慢病毒感染结直肠癌细胞株HCT-116与Caco2,用干扰SNEP1的慢病毒感染结直肠癌细胞株HT-29与SW620,构建稳定细胞系。通过Western blot技术验证稳定细胞系是否构建成功,及SNEP1在结直肠癌细胞中是否也能反馈调控Hh信号通路。3、利用构建好的过表达SNEP1的稳定细胞系,通过克隆形成实验和裸鼠皮下移植瘤实验,检测过表达SNEP1是否能影响结直肠癌细胞的增殖。4、利用构建好的干扰SNEP1的稳定细胞系,通过克隆形成实验和裸鼠皮下移植瘤实验,检测干扰SNEP1是否能影响结直肠癌细胞的增殖。结果:1、过表达SNEP1能促进Gli2和Bcl2的蛋白水平的上调,以及促进SuFu蛋白水平的下调。2、通过Western blot验证结果显示,过表达与干扰SNEP1的结直肠癌稳定细胞系都构建成功。同时,在结直肠癌细胞中SNEP1也能正反馈调控Hh信号通路。3、通过克隆形成实验和裸鼠皮下移植瘤实验,发现过表达SNEP1能促进结直肠癌细胞增殖。4、通过克隆形成实验和裸鼠皮下移植瘤实验,发现干扰SNEP1能抑制结直肠癌细胞增殖。第三部分:SNEP1激活Hedgehog信号通路促进结直肠癌细胞增殖的分子机制方法:1、利用内源与外源蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）实验,以及体外的GST-pulldown实验证明SNEP1与SuFu蛋白具有相互作用,并将SuFu蛋白分段寻找相互作用的位点。2、在过表达SNEP1的条件下,用MG132处理细胞,检测SNEP1是否通过蛋白酶体途径诱导SuFu下调。3、利用酵母双杂交系统,以SNEP1为诱饵蛋白,钓取相互作用蛋白,其中包括E3泛素连接酶LNX1。通过Co-IP实验、GST-pulldown实验验证SNEP1与LNX1的相互作用,并将LNX1分段寻找相互作用的位点。4、过表达或干扰LNX1,通过Western blot检测SuFu蛋白水平的变化。5、同时过表达SNEP1、LNX1,过表达SNEP1的同时干扰LNX1,过表达LNX1的同时干扰SNEP1,通过Western blot检测SuFu蛋白水平的变化。研究SNEP1是否通过介导LNX1促进SuFu下调。6、过表达LNX1,或者过表达LNX1同时干扰SNEP1,检测SuFu蛋白半衰期的变化。7、利用核质分离技术,检测过表达LNX1或SNEP1对Gli2入核的影响。8、Co-IP实验、GST-pulldown实验验证LNX1与SuFu的相互作用,同时检测过表达或者干扰SNEP1对LNX1与SuFu的相互作用的影响。9、通过体内和体外泛素化实验,检测SNEP1与LNX1对SuFu泛素化水平的影响。10、通过SuFu蛋白氨基酸序列保守性分析,预测可能是泛素化位点的赖氨酸残基（K）。然后将这些残基突变成精氨酸（R）,通过Western blot检测突变后是否还受LNX1调控,以此寻找泛素化位点。11、寻找到泛素化位点后,通过泛素化实验验证SuFu泛素化位点突变是否影响泛素化水平,以及通过蛋白半衰期实验检测SuFu泛素化位点突变是否影响SuFu蛋白的半衰期。12、利用EdU实验,在HT-29细胞中检测LNX1诱导SuFu下调对结直肠癌细胞增殖的影响。结果:1、SNEP1与SuFu具有相互作用,且SuFu蛋白的110-174 aa序列是与SNEP1结合的核心序列。2、MG132能抑制SNEP1诱导的SuFu蛋白水平的下调,SNEP1可能通过蛋白酶体降解途径促使SuFu下调。3、LNX1与SNEP1具有相互作用,且通过PDZ1结构域与SNEP1结合。4、过表达LNX1能促进SuFu蛋白水平下调,而干扰LNX1能导致SuFu蛋白水平升高。5、SNEP1与LNX1能够协同促使SuFu下调,干扰SNEP1能阻断LNX1诱导的SuFu下调,干扰LNX1也能阻断SNEP1诱导SuFu下调。6、过表达LNX1能导致SuFu半衰期显著缩短,而在过表达LNX1同时干扰SNEP1却能使SuFu半衰期延长。7、过表达SNEP1和LNX1都能促进Gli2的入核。8、LNX1主要通过RING与PDZ1结构域与SuFu相互作用,过表达SNEP1能增强LNX1与SuFu的相互作用,而干扰SNEP1能明显减弱LNX1与SuFu的相互作用。9、干扰LNX1能抑制SuFu泛素化,SNEP1能增强LNX1对SuFu的泛素化,而干扰SNEP1能抑制LNX1对SuFu的泛素化。同时,体外泛素化实验证实SNEP1能增强LNX1对SuFu的泛素化。10、K59与K470两个位点是SNEP1/LNX1介导SuFu泛素化的位点。11、泛素化位点双突变体SuFu（K59/470R）能明显抑制SuFu的泛素化,SuFu（K59/470R）的半衰期比野生型的SuFu（WT）显著延长。12、LNX1通过促使SuFu下调,增强结直肠癌细胞的增殖能力。第四部分:SNEP1在结直肠癌组织中的表达及与临床病理特征和预后的相关性方法:1、通过免疫组织化学方法检测395例结直肠癌组织及配对癌旁组织中SNEP1和SuFu的表达,然后评分统计。同时,Western blot检测4例结直肠癌组织及配对癌旁组织中SNEP1和SuFu的蛋白表达情况。2、通过统计分析SNEP1和SuFu的表达与临床病理特征的相关性。3、将SNEP1和SuFu的表达水平分成低表达组和高表达组。运用Kaplan-Meier analysis分析低表达组与高表达组结直肠癌患者的生存曲线,并利用Log-Rank检验两者生存曲线的统计学差异。结果:1、免疫组织化学方法检测结果:在结直肠癌组织中SNEP1的表达显著高于癌旁组织（n=395,p<0.001）;而SuFu在结直肠癌组织中的表达显著低于癌旁组织（n=395,p<0.001）。同时,Western blot检测结果与免疫组化结果相同。2、SNEP1的表达水平与糖类抗原CA-125、大体类型、原发灶的大小、分化程度、Dukes分级和是否化疗都具有显著相关性;SuFu的表达水平与年龄、分化程度和Dukes分级均具有显著相关性。并且,SNEP1的表达与分化程度呈负相关性,SuFu的表达与分化程度呈正相关性。3、SNEP1的表达与结直肠癌患者的总生存期和无病生存期均呈负相关,SuFu的表达只与总生存期呈正相关。结论:1、SNEP1是Hh信号通路的新下游靶基因,Gli2直接调控SNEP1的转录。2、SNEP1通过激活Hedgehog信号通路促进结直肠癌细胞增殖。3、SNEP1作为支架蛋白介导LNX1促进SuFu降解,进而激活Hh信号通路促进结直肠癌细胞的增殖。4、SNEP1介导LNX1促进SuFu通过泛素化-蛋白酶体途径降解,且LNX1对SuFu的泛素化位点为K59/470。5、SNEP1在结直肠癌组织中高表达,并且SNEP1可作为结直肠癌潜在的独立预后标志物。