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白介素-2（Interleukin-2,IL-2）作为一种多效性细胞因子,在先天性和获得性免疫中都发挥关键的作用。由于与哺乳动物IL-2基因和蛋白的序列相似性较差,直到2005年,第一个鱼类IL2基因才被成功克隆。尽管随着鱼类基因组数据库的不断完善,硬骨鱼的IL2基因陆续被发现,但硬骨鱼的生理构造和免疫器官与哺乳动物有所不同,这使得对IL-2在硬骨鱼免疫中的认识仍然不足。为了更加系统性的阐明硬骨鱼IL-2的免疫学功能及性质,本论文以草鱼为模型,首先获得具有生物学活性的重组草鱼IL-2蛋白（rgc IL-2）,然后鉴定了IL-2受体（IL-2R）介导的信号转导的功能,最后探究了IL-2对草鱼先天性和获得性免疫细胞的调控作用及机制,具体内容如下:1.草鱼IL-2基因的克隆、生物信息学分析及其蛋白的重组表达和生物学活性鉴定:（1）通过对多种脊椎动物IL2的共线性分析,在草鱼中发现一个疑似IL2的基因序列。通过生物信息学分析和RT-PCR方法,获得了该基因的全长编码序列。氨基酸序列分析显示其具有四个α螺旋结构,符合IL-2家族成员的结构特征。（2）组织分布实验表明IL2 m RNA在一些免疫组织如胸腺和头肾中的表达较高,提示草鱼IL-2可能参与免疫细胞的调控。（3）随后,本研究制备了rgc IL-2,并发现它可以上调外周血白细胞（PBLs）中STAT5的磷酸化,提示该蛋白具有与哺乳动物IL-2类似的激活信号传导及转录激活蛋白5（STAT5）信号通路的活性,可用于后续的研究。2.草鱼IL-2受体（IL-2R）亚基的克隆及其介导IL-2信号的功能鉴定:（1）本研究通过对多种脊椎动物IL2RB基因座两旁的保守基因进行共线性分析,在草鱼基因组中发现了一个新的IL2RBL基因。草鱼IL-2RBL与哺乳动物的IL-2RB的二级结构类似,只是缺乏一个YLXL基序;进化树分析进一步证实该基因是草鱼IL2RB的旁系同源基因。（2）组织分布实验揭示草鱼IL2RB,IL2RBL,IL2RG1和IL2RG2基因的表达具有组织特异性,推测它们可能在不同的组织器官中发挥功能。（3）诱导表达实验显示脂多糖（LPS）和热灭活的嗜水气单胞菌（A.hydrophila）刺激后,四个受体亚基在PBLs中的诱导表达特征存在差异,提示IL-2R不同亚基在免疫应答中可能存在不同分工。（4）在哺乳动物中,IL-2R复合物的两个亚基分别由IL2RB和IL2RG编码。为了比较IL-2R亚基不同组合在介导草鱼IL-2信号中的作用,将两类亚基受体（IL-2RB和IL-2RG）成对在COS-7细胞中过表达,检测STAT5的磷酸化水平。结果显示仅有IL-2RB和IL-2RG1亚基组成的受体复合体能介导IL-2对STAT5的激活,揭示鱼类与哺乳动物类似,能以IL-2RB和IL-2RG组成的双亚基受体复合体传递IL-2信号。3.草鱼IL-2对头肾白细胞（HKLs）增殖及免疫细胞标志物分子基因表达的调控:（1）本研究以草鱼重要免疫器官头肾中的白细胞作为研究对象,探究草鱼IL-2对免疫细胞的调控作用。结果显示,rgc IL-2长时间（72 h）处理可显著促进HKLs的增殖,同时,HKLs中辅助性T细胞标志物分子CD4L基因的表达被显著上调,表明鱼类IL-2与哺乳动物类似,可以促进免疫细胞特别是辅助性T细胞的增殖。（2）其次,rgc IL-2短时间（<48 h）处理可刺激HKLs中辅助性T细胞（IFNg2,IL12p35a,IL12p35b,IL2,TBET,TNFA,IL4/13A,IL4/13B和GATA3）,调节性T细胞（FOXP3和CD25L）以及杀伤性细胞（PRFL,GZMBL和FASL）的标志物分子基因的表达,暗示鱼类IL-2参与获得性免疫细胞的发育和扩增进程。4.草鱼IL-2对中性粒细胞颗粒酶B样（GZMBL）和穿孔素样（PRFL）蛋白表达的调控及其对中性粒细胞杀伤A.hydrophila的影响:（1）首先,本研究使用密度梯度离心法分离草鱼外周血来源的中性粒细胞,并通过吉姆萨染色和髓过氧化物酶（MPO）染色方法对细胞进行鉴定。（2）免疫荧光染色和蛋白免疫印迹（WB）结果显示GZBML和PRFL蛋白在草鱼中性粒细胞中表达且呈点状分布,提示这两种细胞毒性蛋白可能在中性粒细胞中发挥功能。（3）随后的实验证实:rgc IL-2可通过ERK,NF-κB和STAT5以及糖酵解途径上调中性粒细胞中GZMBL和PRFL的m RNA和蛋白表达,从而为IL-2参与调控中性粒细胞功能提供有力证据。（4）不仅如此,抗体免疫中和实验进一步证明rgc IL-2上调的GZMBL和PRFL蛋白可以有效提高中性粒细胞杀灭A.hydrophila的能力。以上结果表明颗粒酶B和穿孔素不仅是NK细胞以及CTL细胞的效应分子,也是中性粒细胞杀伤细菌的有利武器,而IL-2作为这些效应分子的调控因子,可以增强先天性免疫细胞在免疫防御中的作用。5.草鱼IL-2对中性粒细胞死亡方式的调控及其机制的探究:（1）通过Annexin V/PI双染和流式细胞术检测发现rgc IL-2对草鱼中性粒细胞的早期凋亡有显著的抑制作用。不仅如此,该蛋白还可显著上调胞外诱捕网死亡（NETosis）的相关指标,这些结果提示IL-2可以抑制中性粒细胞的凋亡且诱导其NETosis的发生。（2）接下来的研究中发现,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶和线粒体来源的活性氧（ROS）均参与rgc IL-2诱导的NETosis的发生。（3）此外,阻断实验证实自噬途径也参与了rgc IL-2诱导的NETosis的发生。（4）WB及免疫荧光实验结果表明rgc IL-2促进了高迁移率族蛋白B（HMGB）1的核-质转移,使用HMGB1的抑制剂显著抑制了rgc IL-2诱导的自噬标志物微管相关蛋白轻链3（LC3）II的上调及NETosis的发生,从而证明草鱼IL-2可以经由HMGB1-自噬途径调控NETosis,而其中HMGB1亚细胞定位的改变可能触发自噬起始的信号。（5）如前所述,IL-2诱导NETosis的发生依赖于ROS的产生和自噬途径,但进一步实验证明这两个途径可能独立参与IL-2对NETosis诱导过程。上述工作阐明了ROS产生和自噬途径在IL-2诱导NETosis发生中的作用,同时提供草鱼IL-2精确调控中性粒细胞死亡方式的证据。6.rgc IL-2预处理在草鱼抵抗A.hydrophila感染中的作用:预处理不仅降低A.hydrophila感染的草鱼外周血中的细菌载量,而且提高A.hydrophila感染草鱼的存活率。这些结果证实IL-2可以为草鱼提供保护,使其更有效的应对A.hydrophila的感染,且前述IL-2对多种免疫细胞的调控可能在该保护中起到积极的作用。综上所述,本论文在克隆草鱼IL2基因并获得具有生物学活性的rgc IL-2的基础上,对草鱼IL-2的信号转导及其调控HKLs及中性粒细胞的机制进行了研究。该研究不仅明确了IL-2受体以双亚基形式传递信号,而且阐明了草鱼IL-2对HKLs中T淋巴细胞群的标志物分子的调节作用,更重要的是该研究证明了草鱼IL-2可通过诱导细胞毒性蛋白的表达和NETosis的发生来增强中性粒细胞的杀菌能力。这些结果不仅确立了鱼类IL-2在先天性和获得性免疫中的关键地位,而且为开发IL-2作为免疫调节剂应用于鱼类养殖中细菌性疾病的防治提供新思路。