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第一部分：红霉素对烟草烟雾暴露下人巨噬细胞释放活性氧及炎症因子的作用目的：1.观察烟草烟雾刺激对人巨噬细胞产生活性氧的影响,以及红霉素能否调控由烟草烟雾暴露介导的人巨噬细胞活性氧(Reactive oxygen species, ROS)释放。2.观察烟草烟雾刺激条件下,人巨噬细胞释放的白细胞介素6(interleukin 6, IL-6)、白细胞介素8(interleukin 8, IL-8)、肿瘤坏死因子a (tumor necrosis factor a, TNF-α)水平改变,以及红霉素对于烟草烟雾暴露下人巨噬细胞释放炎症因子水平的影响。方法：研究对象为人淋巴瘤单核细胞株U937,经10nM佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)诱导24h后,U937转换成巨噬细胞,用香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)刺激人巨噬细胞。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CSE及红霉素对细胞最适宜作用浓度。细胞分组：对照组,CSE组(加入1%CSE孵育24h),CSE+红霉素24h组(1μg/ml红霉素预孵育24h后,加入1%CSE继续刺激24h),CSE+红霉素48h组(1μg/ml红霉素预孵育48h后,加入1%CSE继续刺激24h)。各细胞组在红霉素(Erythromycin, EM)、CSE干预下,以2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酯(2’,7’-dichlorofluorescin-diacetate, DCFH-DA, 10mM)作为荧光探针,流式细胞术检测各组细胞中ROS水平。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各实验组细胞上清液中IL-6、IL-8、 TNF-α释放水平。结果：1%浓度的CSE能显著上调人巨噬细胞ROS的释放(P<0.01),红霉素(lug/ml)预孵育24h、48h能抑制1%CSE对细胞ROS的上调作用(p<0.01),SIRT1特异性抑制剂(NAM)显著上调人巨噬细胞ROS的释放(P<0.01)；CSE 1%增加人巨噬细胞释放IL-6、IL-8、TNF-α,红霉素(lug/ml)预孵育24h减少IL-6、TNF-α释放(p<0.01)。红霉素(lug/ml)预孵育48h对人巨噬细胞释放IL-6、IL-8、TNF-α的抑制作用更加明显(p<0.01)。结论：1.烟草烟雾刺激引起人巨噬细胞释放活性氧增多,红霉素抑制氧化应激机制之一是通过抑制活性氧释放。2.烟草烟雾刺激促进人巨噬细胞释放IL-6、IL-8、TNF-α增加,红霉素抑制炎症机制之一通过抑制人巨噬细胞释放IL-6、IL-8、TNF-α。第二部分：红霉素对烟草烟雾刺激下人巨噬细胞内SIRT1、NF-κB蛋白表达及两种蛋白之间的相互作用目的：观察人巨噬细胞中SIRT1及NF-κB蛋白表达在烟草烟雾暴露条件下的改变,以及红霉素对烟草烟雾刺激条件下SIRT1和NF-κB蛋白表达产生何种影响。观察人巨噬细胞中SIRT1及NF-κB蛋白是否存在相互作用,以及在烟草烟雾暴露、红霉素治疗下,存在何种相互作用关系。方法：1.用10nmol/ml PMA孵育24h可将人淋巴瘤单核细胞株U937诱导分化成巨噬细胞,用CSE刺激巨噬细胞,制造细胞在烟草烟雾暴露氧化应激模型。分为：对照组,CSE组,CSE+红霉素24h组,CSE+红霉素48h组,NF-κB蛋白特异性抑制剂PDTC组(20nM PDTC预孵育24h后加入1%CSE继续孵育24h),SIRT1特异性抑制剂NAM组(20mM NAM孵育24h)。用western blot (WB)方法检测各组细胞中NF-κB、SIRT1蛋白表达。2.将U937诱导分化成巨噬细胞后,对细胞分组并进行实验。分为：对照组,CSE组,CSE+红霉素24h组,CSE+红霉素48h组。提取各组细胞总蛋白,先用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)进行蛋白沉淀,再用westernblot (WB)方法检测各组细胞中NF-κB、SIRT1蛋白表达。结果：1.CSE暴露会导致人巨噬细胞中SIRT1蛋白表达明显下降,并能增加NF-κB蛋白表达,经红霉素预孵育24h后再予CSE刺激,能促进人巨噬细胞中SIRT1蛋白表达升高,同时抑制NF-κB蛋白表达升高,经红霉素预孵育48h后,对人巨噬细胞中SIRT1蛋白表达升高以及对NF-κB蛋白的抑制作用更加明显。结果：1.CSE暴露会导致人巨噬细胞中SIRT1蛋白表达明显下降,增加NF-κB蛋白表达,经红霉素预孵育24h、48h,均促进人巨噬细胞中SIRT1蛋白表达升高,同时抑制NF-κB蛋白表达升高,其中48h组更明显。2.经Co-IP检测,SIRT1和NF-κB蛋白在人巨噬细胞内存在直接相互作用,CSE刺激可导致SIRT1蛋白表达减少,从而促进NF-κB蛋白表达增加,经红霉素预孵育24h、48h,可增加人巨噬细胞中SIRT1蛋白表达,抑制NF-κB蛋白表达。结论：1烟草烟雾导致炎症的机制可能是通过氧化应激抑制人巨噬细胞SIRT1蛋白表达,进而促进NF-κB蛋白表达,从而促进炎症介质IL-6、IL-8、 TNF-α释放。2.红霉素抑制氧化应激诱导的炎症机制可能是通过红霉素增加SIRT1蛋白表达,进而抑制NF-κB蛋白表达,从而抑制炎症介质释放。第三部分：红霉素对烟草烟雾暴露小鼠肺组织以及肺组织中SIRT1与NF-κB蛋白作用目的：观察烟草烟雾暴露对小鼠肺组织的影响,以及红霉素对烟草烟雾暴露小鼠肺组织的作用。观察受烟草烟雾暴露刺激小鼠的肺组织中SIRT1及NF-κB蛋白表达的改变,以及红霉素对烟草烟雾刺激下对小鼠肺组织内SIRT1及NF-κB蛋白表达的作用。方法：将8周大小的雄性BALB/c小鼠分为：对照组,烟草烟雾暴露组,红霉素治疗组。烟草烟雾暴露组每天烟草烟雾暴露2h,持续12w,红霉素治疗组在烟草烟雾暴露前用红霉素(100mg/kg-day)灌胃治疗,余处理同烟草烟雾暴露组。建模到期后取右肺组织切片行HE染色,剩余肺组织行westernblot检测各组小鼠肺组织中NF-κB、SIRT1蛋白表达。结果：1.烟草烟雾暴露小鼠肺组织中出现炎症,支气管周围炎症细胞聚集,肺组织出现肺气肿表现。红霉素治疗组炎症反应较烟草烟雾暴露组减轻,肺气肿表现减轻。2.烟草烟雾暴露小鼠肺组织中SIRT1蛋白较对照组明显减少,NF-κB蛋白明显增加。红霉素治疗组小鼠肺组织中SIRT1蛋白较对照组减少,但较烟草烟雾暴露组表达增加。结论：1.红霉素减轻烟草烟雾暴露引起的小鼠肺组织炎症,可能与红霉素上调肺组织SIRT1蛋白表达,抑制肺组织中NF-κB蛋白表达相关。2.红霉素减轻小鼠肺气肿,可能与红霉素促进SIRT1表达相关。