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目的探究短暂缺氧对三日龄大鼠嗅球内Wnt/β-catenin信号通路下游相关因子表达的影响,从神经保护层面出发为临床治疗早产儿缺氧性脑病提供基础实验依据。方法1.建立新生大鼠缺氧脑损伤模型,本课题参照改良的Dan的方法将出生后3 d SD大鼠置于氮氧混合气体中持续缺氧2 h。缺氧期间,观察并记录新生鼠神经行为学变化。缺氧结束后取嗅球组织进行重量观察、尼氏染色和透射电镜检测综合评价动物缺氧模型。2.成功建立缺氧模型基础上,采用随机数据表法将新生鼠分成空白组和缺氧组,于缺氧后2 h、4 h、1 d、7 d、12 d、17 d六个时间点取材,运用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫荧光染色技术探究短暂缺氧对Active-β-catenin、Neuro D1、insulin、insulin receptor的m RNA和蛋白表达的影响。结果1.缺氧模型评价与空白组相比,缺氧组新生鼠:1)神经行为学改变:新生大鼠缺氧时出现不同程度行为改变,例如呼吸频率加快,四肢颤抖,全身抽搐等。2)嗅球重量改变:缺氧后1 d无明显差异,缺氧后12 d重量减少。3)组织学改变:整体结构紊乱,颗粒层密度和厚度减小,僧帽细胞层细胞形态异常,尼氏体深染减少,外丛层可见少量颗粒细胞。4)超微结构改变:颗粒细胞部分核膜边界不清,线粒体微肿,偶见凋亡细胞;僧帽细胞线粒体肿胀,内质网松散扩张;血管内皮出现水肿。2.实时荧光定量PCR与空白组相比,缺氧组新生鼠:1)缺氧后2 h,Active-β-catenin、Neuro D1和insulin receptor m RNA相对表达量均无明显变化,insulin m RNA相对表达量降低(P<0.01)。2)缺氧后4 h,Active-β-catenin、Neuro D1和insulin receptor m RNA相对表达量依然无明显变化,insulin m RNA相对表达量依然降低(P<0.05)。3)缺氧后1 d,Active-β-catenin(P<0.05)、insulin(P<0.01)和insulin receptor(P<0.05)m RNA相对表达量均升高,Neuro D1m RNA相对表达量降低(P<0.05)。4)缺氧后7 d,Active-β-catenin和insulin receptor m RNA相对表达量均无明显变化,Neuro D1 m RNA相对表达量升高(P<0.01),insulin m RNA相对表达量降低(P<0.01)。5)缺氧后12 d,Active-β-catenin和insulin receptor m RNA相对表达量依然无明显变化,Neuro D1(P<0.05)和insulin(P<0.01)m RNA相对表达量均降低。6)缺氧后17 d,Active-β-catenin和insulin receptor m RNA相对表达量均升高(P<0.05),Neuro D1和insulin m RNA相对表达量均降低(P<0.05)。3.蛋白免疫印迹与空白组相比,缺氧组新生鼠:1)缺氧后2 h和4 h,Active-β-catenin、Neuro D1和insulin蛋白相对表达量均下降(P<0.01),insulin receptor蛋白相对表达量无明显变化。2)缺氧后1 d,Active-β-catenin蛋白相对表达量升高(P<0.05),Neuro D1蛋白相对表达量降低(P<0.05),insulin和insulin receptor蛋白相对表达量无明显变化。3)缺氧后7 d,Active-β-catenin蛋白相对表达量下降(P<0.01),Neuro D1(P<0.01)、insulin(P<0.05)和insulin receptor(P<0.01)蛋白相对表达量均升高。4)缺氧后12 d,Active-β-catenin和insulin receptor蛋白相对表达量无明显变化,Neuro D1(P<0.05)和insulin(P<0.01)蛋白相对表达量均升高。5)缺氧后17 d,Active-β-catenin和Neuro D1蛋白相对表达量均降低(P<0.01),insulin和insulin receptor蛋白相对表达量均升高(P<0.01)。4.免疫荧光染色与空白组相比,缺氧组新生鼠:1)缺氧后2 h和4 h,Active-β-catenin蛋白、Neuro D1蛋白和insulin蛋白荧光强度均有不同程度减弱,insulin receptor蛋白荧光强度无明显差别。2)缺氧后1 d,Active-β-catenin蛋白和insulin receptor蛋白荧光强度均有增高,Neuro D1蛋白荧光强度减弱,insulin蛋白荧光强度无明显变化。3)缺氧后7 d,Neuro D1蛋白、insulin蛋白和insulin receptor蛋白荧光强度均增高,Active-β-catenin蛋白荧光强度减弱。4)缺氧后12 d,Neuro D1蛋白荧光强度增高,其他目的蛋白变化不明显。5)缺氧后17 d,Active-β-catenin蛋白和Neuro D1蛋白荧光强度均减弱,insulin蛋白和insulin receptor蛋白荧光强度均增高。结论1.选择出生后3d SD大鼠模拟早产儿,置于混合气体中持续缺氧2 h,成功建立早产儿缺氧脑损伤相似的病理模型。2.短暂缺氧主要引起嗅球颗粒层,僧帽细胞层和突触小球层变化,可激活三日龄大鼠嗅球中Wnt/β-catenin/Neuro D1信号通路,刺激其下游因子表达量发生应激性变化,可能对受损的脑组织进行代偿性修复,在神经细胞再生过程中发挥一定作用。