对基因组序列进行功能研究,首先需要对目的DNA序列进行克隆。随着DNA测序技术的不断进步,越来越多生物的全基因组被测序,因此人们获得了大量的基因组序列。DNA文库构建和筛选的传统方法,由于耗时和低效率,不利于基因组序列的高通量克隆。RaC前噬菌体编码的全长的核酸外切酶RecE和单链结合蛋白质RecT能以很高的效率介导两个线性DNA分子之间发生同源重组(Linear-linear homologous recombination, LLHR)。利用全长的RecE/RecT介导的LLHR对细菌基因组上的DNA片段进行直接克隆时,我们发现背景菌落主要是由线性克隆载体发生分子内重组导致的。为了尽可能的减少LLHR的背景菌落,提高从复杂样品中直接克隆DNA片段的能力,本研究对RecE/RecT介导的LLHR效率进行了优化,并建立了“双抗生素法”和“两步重组法”的直接克隆策略。利用这两种策略,成功克隆了位于发光杆菌染色体上的10个聚酮合酶和非核糖体多肽基因簇,其中最小的10 kb,最大的52 kb.RecE/RecT介导的LLHR不仅可以用于基因组DNA片段的直接克隆,还可以用于合成生物学,以构建复杂的DNA通路。Red/ET重组工程是在E. coli细胞内,利用重组酶Reda/β或者RecE/T介导的同源重组对DNA分子进行精确修饰的技术。反向筛选常常被用于Red/ET重组工程中,进行DNA的点突变和模块替换等无痕修饰。ccd操纵子是存在于E. coli F质粒上的毒素-抗毒素系统。该系统包括CcdB毒蛋白和CcdA解毒蛋白。CcdB毒蛋白作用于解旋酶的GyrA亚基,影响DNA复制和转录,并导致细胞死亡。因此,CcdB反向筛选的时候,不需要向培养基中添加任何额外的抗生素或化学物质。根据靶标DNA分子的拷贝数不同,本研究建立了相应的不同的ccdB反向筛选策略。对于多拷贝质粒,重组后的细胞内容易产生重组前后质粒的混合物。联合使用两个E. coli宿主,通过两步共转化,可以达到分离重组前后质粒和反向筛选的目的。对于单拷贝DNA分子,将ccdA基因置于温度敏感的pSC101 Red表达质粒上,通过改变培养温度和去除诱导剂可以达到反向筛选的目的。与现有的反向筛选方法相比,ccdB使用起来更方便,因此非常有利于细菌人工染色体,质粒和E. coli染色体的修饰。土壤放线菌刺糖多孢菌产生的多杀菌素杀虫谱广,对靶标害虫高效,而且对非靶标昆虫和哺乳动物安全,是很有前景的生物杀虫剂。但是由于刺糖多孢菌多杀菌素产量低,生产成本高,限制了其大规模推广应用。对刺糖多孢菌进行遗传修饰,是提高多杀菌素产量的一种有效手段。目前,对刺糖多孢菌的遗传修饰主要依赖于接合转移和同源重组,但是同源重组效率低,很难对其有效的修饰。本研究对转座子在刺糖多孢菌遗传修饰中的应用进行了探索。将mariner转座酶基因置于红霉素抗性基因启动子的控制下,通过接合转移使其在刺糖多孢菌细胞内表达之后,成功将两端带有转座酶识别序列的外源基因整合到了染色体上。mariner转座子在刺糖多孢菌遗传修饰中的成功应用不仅有利于菌种改良,而且有利于其次级代谢调控网络和次级代谢产物多样性研究。