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猪伪狂犬病(Pseudorabies, PR)是伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)引起的一种猪的重要传染病,主要临床症状包括：新生仔猪中枢神经系统紊乱、断奶仔猪和育肥猪表现出呼吸道症状、妊娠母猪繁殖障碍,给世界生猪养殖业带来巨大的经济损失。目前,防控伪狂犬病主要依靠疫苗免疫,美国与部分欧洲国家已宣布通过基因缺失疫苗免疫和净化技术,根除了该病在家猪中的流行。近30年来,我国广泛使用PRV基因缺失弱毒疫苗有效控制并逐步净化。但是,2011年以来,我国许多免疫PRV活疫苗的猪场出现仔猪神经症状及死亡,生长猪呼吸道症状并部分死亡,妊娠母猪流产、死胎、弱仔等疑似PR的临床症状。本研究在病原学调查基础上,从我国发病猪场分离获得5株PRV,并以PRVZJ01毒株为研究对象,系统地研究其毒力、抗原特性和基因组特征,并成功构建了ZJ01株的感染性细菌人工染色体克隆,获得ZJ01 gE/gI基因缺失病毒,观察其灭活疫苗免疫特性,为进一步开展PRV变异毒株进化机制和新型疫苗研究奠定基础。本研究内容分为以下5个部分：1.中国东南部猪伪狂犬病病毒超强毒株分离与鉴定伪狂犬病病毒是威胁养猪业的重要病原之一。自2011年底起,我国许多该病毒免疫猪场相继出现仔猪呕吐和神经症状、生长猪出现呼吸道症状,死亡率明显增高,妊娠母猪出现流产、死胎、弱仔等,造成严重经济损失。本研究从我国东南部4省份13个发病猪群采集38份疑似患病仔猪组织病料,29份组织病料经PCR检测为PRV野毒阳性。选取5份阳性组织病料进行病毒分离及基因扩增,病料经无菌处理后接种BHK-21细胞,培养24h出现明显细胞病变,病毒空斑纯化3次后经PCR与电镜观察鉴定为PRV,分别命名为PRVZJ01、ZJ02、GDO1、GX01和JX01毒株。病毒gE和gC基因序列进化树分析结果显示,这些新分离株均位于相对独立的分支,与亚洲分离株亲缘关系较近。gE和gC基因序列推导的氨基酸序列分析结果显示,新流行毒株与先前分离毒株相比分别有2个与7个氨基酸的插入。将PRV ZJ01分离株接种BALB/c小鼠,接种3d后出现奇痒并死亡。家兔免接种该毒株病毒液后32h后,表现精神亢奋,咬接种部位直至溃烂,并相继死亡。取24和80-85日龄PRV阴性健康猪滴鼻接种PRV ZJ01分离株,均出现发热,精神沉郁,呕吐,咳嗽,呼吸困难和神经症状等症状及肝脏灰色坏死等病理变化,攻毒后7d内全部死亡。选择15头80～85日龄健康猪,随机分为3组,第1、2组分别滴鼻接种分别滴鼻接种1070TCID50PRVZJ01株和传统毒株LA病毒液,第3组按同样方式接种细胞培养物作为空白对照,结果为：试验猪感染ZJ01后临床症状明显,攻毒后7d内全部死亡,组织病理变化明显,而LA接种组仅表现体温变化与轻微呼吸道症状,组织病理变化轻微,表明新分离毒株ZJO1毒力明显增强。综上所述,我国东南部地区出现猪伪狂犬病病毒流行,毒力明显增强,PRV ZJ01株可定义为超强毒株。2.猪伪狂犬病病毒超强毒株ZJ01抗原特性研究为了进一步明确猪伪狂犬病超强毒株的抗原特性,本研究采用ZJ01毒株及其血清抗体,分别与PRV Bartha-K61、Bucharest和HB-98疫苗毒株及其抗血清进行交叉中和试验,结果显示,其变异系数R值为0.378～0.455,证明该分离毒株抗原发生明显变异。采用ZJ01油佐剂灭活疫苗与Bartha-K61弱毒疫苗进行猪体免疫保护试验,结果为：灭活疫苗免疫后产生的LA株特异性中和抗体水平与活疫苗组相似,但ZJ01特异性中和抗体水平显著高于活疫苗组。PRVZJ01攻毒后灭活疫苗组仅出现短时间发热及轻微的呼吸道症状,相对日增重明显高于攻毒对照组,脑组织与肺组织中抗原载量均明显低于攻毒对照组。Bartha-K61活疫苗组攻毒后出现明显呼吸道症状与神经症状,弱毒疫苗免疫组相对日增重明显低于灭活疫苗组,脑组织与肺组织中抗原载量明显高于灭活疫苗组,表明Bartha-K61疫苗不能对ZJ01提供完全保护。综合上述结果,PRV ZJ01毒株抗原性出现明显变异。3.猪伪狂犬病病毒超强毒株ZJ01全基因组序列测定与分析本研究采用PRV ZJO1毒株病毒液,通过病毒纯化和浓缩,提取纯化病毒基因组DNA,应用Ion Torrent高通量测序方法和20个gap基因片段的PCR基因测序补充,获得PRV ZJO1基因组序列,并对全长基因组序列编码基因定位及ORFs分析,结果显示：该病毒基因全长共141029 bp, GC含量达73.5%,BamH1酶切位点分析结果与纯化DNA BamHl脉冲场凝胶电泳带型完全吻合。PRV ZJO1编码69种蛋白；相对Bartha-K61疫苗毒株、Kaplan与Becker强毒株,ZJ01株重要的编码蛋白AA具有突变、插入与缺失现象,例如：gE蛋白AA序列的46位插入D,第418位有V>A突变；gI糖蛋白AA序列在第29(V>A)、238-246与340(N>T)有变异；与中国传统毒株Ea或HNYD-2008-China相比,ZJ01株gB糖蛋白第75-77插入三个AA(+SPG),59-126AA与540-734AA也有多处变异位点；与欧美分离株Becker和Kaplan及中国传统毒株Ea与SA215相比,ZJ01毒株gC糖蛋白第63-67位插入7个AA(+AAASTPA). UL2蛋白有7个AA连续插入,UL12基因也有1个AA插入,UL50第22位有AA有插入,同时伴有许多特异性点突变；IE180即刻早期基因蛋白也有多处插入、缺失及点突变。此外、,ZJ01毒株UL30、UL34、UL39、UL14、EP0、IE180、UL1、US2与US6基因的调控序列也有较多突变。基因进化树分析结果表明,ZJ01分离株处于相对独立的分支。PRV ZJ01全基因组序列的解析有助于进一步研究其毒力及抗原变异机制。4.猪伪狂犬病病毒超强毒株ZJ01感染性细菌人工染色体克隆的构建与鉴定自2011年底起,我国许多伪狂犬病免疫猪群相继出现仔猪呕吐和神经症状、生长猪出现呼吸道症状,死亡率明显增高,妊娠母猪出现流产、死胎、弱仔等,造成严重经济损失,对伪狂犬病病毒一流行毒株PRVZJ01的致病性和抗原性研究已经证明：该流行毒株为强毒力伪狂犬病病毒抗原变异株。本研究设计2对引物,经PCR扩增位于PRVZJ01毒株US7和US8 (gE/gI)基因序列两端同源重组臂,与携带细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome, BAC)载体和加表达盒的pHA2质粒分别连接,构建转移载体pHA2-pUC19-H1-H2。将该转移载体与ZJ01毒株全基因组共转染BHK-21细胞,通过同源重组,将含mini-F和加表达盒的基因插入到PRV ZJ01病毒的US7与US8(gI与gE)基因内,获得重组病毒vZJ01-GFPAgE/gI。提取该重组病毒的环状基因组DNA,电转化到感受态大肠杆菌宿主菌DH10B,筛选获得含有mini-F序列的PRV感染性BAC克隆(pZJ01)。将pZJ01转染BHK-21细胞可以重新启动病毒的生产性感染,该质粒与pUC19-H1-H2或gE/gI基因片段全长共转染BHK-21细胞,通过同源重组进一步删除mini-F序列,构建获得gE/gl基因双缺失病毒vZJO1ΔgE/gl或无痕恢复病毒vZJ01gE/gI-R。拯救获得的3个病毒vZJ01-GFPAgE/gI、 vZJ01ΔgE/gI与vZJ01gE/gI-R产生的细胞病变和体外增殖特性与亲本病毒ZJ01一致,表明gE/gI基因的删除或BAC载体的插入不会影响PRV体外复制。将ZJ01和vZJ01ΔgE/gl接种小鼠和家兔,vZJ01ΔgE/gl攻毒组小鼠与家兔比ZJ01攻毒组存活时间明显延长。55～60日龄健康猪滴鼻接种等量PRVZJ01和vZJ01ΔgE/gI,结果显示,ZJ01攻毒组猪临床症状明显,攻毒后7d内全部死亡,具有PRV典型组织病理变化,vZJ01ΔgE/gl攻毒组后仅表现轻度体温反应,14d观察期内未出现死亡,组织学病理变化轻微。上述结果表明,本研究成功构建PRVZJ01感染性BAC克隆,拯救获得的gE/gI基因缺失病毒vZJ01ΔgE/gI对猪毒力明显减低,为PRV基因功能和载体疫苗研究奠定了重要基础5.猪伪狂犬病病毒超强毒ZJO1 gE/gI基因缺失株灭活疫苗免疫保护作用本研究将猪伪狂犬病病毒超强毒株ZJO1 gE/gI基因缺失病毒vZJ01ΔgE/gI经甲醛灭活处理,制成油乳剂灭活疫苗,以Bartha-K61活疫苗作为对照组进行仔猪免疫保护试验,评价vZJ01ΔgE/gI灭活疫苗的免疫保护效果。结果为：vZJ01ΔgE/gI灭活疫苗免疫组猪PRV gB抗体均为阳性,gE抗体均为阴性。两个免疫组产生的Bartha-K61特异性中和抗体水平相似(P>0.05), vZJ01ΔgE/gl免疫组产生的ZJ01特异性中和抗体水平显著高于Bartha-K61活疫苗组(P<0.05)。试验猪滴鼻攻击PRVZJ01后,非免疫攻毒对照组出现严重临床症状,表现明显呼吸道症状与神经症状,并在攻毒后7d内全部死亡。vZJ01ΔgE/gI灭活疫苗组攻毒后无明显临床症状,脑和肺组织PRV载量明显低于攻毒对照组(P<0.05),而Bartha-K61免疫组2/5猪出现明显临床症状,相对日增重明显低于空白对照组(P<0.05),脑和肺组织PRV载量明显高于vZJ01ΔgE/gI灭活疫苗组和空白对照组(P<0.05),表明vZJO1ΔgE/gl灭活疫苗能抵御致死量PRVZJ01攻击。上述结果表明,PRVZJ01gE/gI基因缺失株vZJO1ΔgE/gI灭活疫苗可以提供对PRV超强毒的免疫保护作用,其免疫效果优于Bartha-K61活疫苗,而且免疫抗体可以与PRV野毒抗体相区分,为我国防控变异PRV奠定了重要基础。综上所述,自2011年下半年开始,我国东南部地区出现猪伪狂犬病病毒流行。PRVZJ01毒株毒力明显增强,抗原性发生变化,故将其定名为伪狂犬病病毒超强毒株。根据ZJ01全基因组测序和基因进化树分析,ZJ01属于一个独立基因分支。同时,成功构建PRV ZJ01感染性BAC克隆,获得ZJO1 gE/gI基因缺失毒株vZJ01ΔgE/gI,证明其灭活疫苗能有效抵御致死量ZJ01的攻击,为我国该病防控奠定了重要基础。