论文部分内容阅读
鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)又称为鸡毒霉形体,可引起鸡的慢性呼吸道疾病。该病感染率较高,可导致肉鸡增重和种鸡的产蛋量下降,还会降低种蛋的孵化率,增加雏鸡的淘汰率,且易与大肠杆菌、新城疫等混合感染,增加病死率,使养禽业遭受巨大的经济损失。因此研发治疗MG感染的药物显得尤为重要。本课题根据中兽医理论和辩证施治原则进行中药组方,并通过前期处方筛选确定将黄芩、板蓝根、甘草、百部、紫菀五种中草药制成复方口服液(命名为芩蓝口服液),发挥清热解毒、抑菌消炎、润肺止咳的功效。本研究拟对芩蓝口服液的提取工艺、醇沉工艺、水沉工艺、以及成型工艺进行全面的优化,同时在确定药物疗效的基础上进行其抗MG感染的信号机制研究,试验结果如下:(1)在提取工艺中,将黄芩苷含量和固体得率作为检测指标,采用单因素考察结合L9(3~4)正交试验进行综合评价,确定芩蓝口服液的优化提取工艺为:提取温度固定在95℃,用20倍量的水将处方中的各成分煎煮两次,每次1 h。收集两次的煎煮液,将其70℃减压浓缩到相对密度为1.05～1.15之间。在醇沉工艺中,将黄芩苷含量和固体得率作为检测指标,采用单因素考察结合L9(3~4)正交试验进行综合评价,确定醇沉工艺为:将煎煮液放置在真空干燥箱中70℃减压浓缩到相对密度为1.10,醇沉浓度为70%,醇沉15 h,去除沉淀,回收多余的乙醇。水沉工艺中,将溶液的澄明度作为考察指标,采用L9(3~4)正交试验,确定水沉工艺为:将回收乙醇后的提取液放置在真空干燥箱中,70℃减压浓缩到相对密度为1.10,加水量至总量的50%,水沉48 h。在制剂成型试验中,对溶液的pH值、防腐剂进行考察,最终筛选为药液pH在4.0～5.5之间,添加0.02%的尼泊金甲酯作为防腐剂。(2)将80只生长状态良好的1日龄雏鸡随机分成4组,每组20只,分别为空白对照组、药物组、MG感染组、芩蓝口服液治疗组。将雏鸡饲喂到7日龄,将MG感染组与芩蓝口服液治疗组的每只鸡左侧气囊注射菌液浓度为1×10~9 CCU/m L的MG培养液0.2 m L,空白对照组与药物组注射0.2 m L的生理盐水。感染后第3天,给予药物组与芩蓝口服液治疗组混水饲喂芩蓝口服液,连续给药7 d,早晚各一次。结束给药后,剖检采出胸腺。通过光学显微镜观察发现,雏鸡在感染MG后,胸腺小叶明显萎缩,小叶之间的间隔增大,皮质、髓质之间界限不清晰,淋巴细胞数量减少,且排列稀疏,上皮细胞有脱落现象。相比于MG感染组,芩蓝口服液治疗组的病理学变化都有所改善,而药物组与空白对照组几乎无差异,说明芩蓝口服液对雏鸡不会造成损伤,却可以减轻MG感染引起的病理损伤。基于IL-17通路的芩蓝口服液对MG感染的作用研究,RT-PCR结果显示:与空白对照组相比,MG感染组胸腺中IL-17C、MMP1、CXCL1的m RNA表达水平无显著性差异(P>0.05)。从IL-17A、IL-17B、IL-17F、CXCL2、AP-1、NF-kB、CIKS、GM-CSF的m RNA表达水平可以看出,MG感染组与空白对照组差异极显著(P<0.01),芩蓝口服液治疗组与MG感染组相比具有极显著性差异(P<0.01);从C/EBPb、MMP3的m RNA表达水平来看,MG感染组与空白对照组相比差异显著(P<0.05),芩蓝口服液治疗组与MG感染组也具有显著性差异(P<0.05)。值得注意的是MUC5AC的m RNA表达水平,MG感染组与空白对照组相比,差异极显著(P<0.01),芩蓝口服液治疗组与MG感染组相比,差异极显著(P<0.01),说明芩蓝口服液能够下调MG引起的雏鸡胸腺IL-17A、IL-17B、IL-17F、CXCL2、AP-1、NF-kB、CIKS、GM-CSF、C/EBPb、MMP3、MUC5AC m RNA的表达。ELISA结果显示:与空白对照组相比,MG感染组雏鸡胸腺中CXCL1、CXCL2、MMP1的蛋白表达水平显著提高(P<0.05),MUC5AC蛋白表达水平极显著提高(P<0.01);与空白对照组相比,药物组雏鸡胸腺中CXCL1、CXCL2、MMP1、MUC5AC的蛋白表达水平没有显著性差异(P>0.05),而芩蓝口服液治疗组与MG感染组相比,胸腺中CXCL1、CXCL2、MMP1、MUC5AC的蛋白表达水平显著降低(P<0.05),说明芩蓝口服液能够抑制MG感染造成的CXCL1、CXCL2、MMP1、MUC5AC蛋白的过表达。综上,本研究优化芩蓝口服液提取、醇沉、水沉、成型一系列工艺,并且证明芩蓝口服液可以通过抑制IL-17通路的相关因子发挥抗雏鸡MG感染的作用。