论文部分内容阅读
一、背景与目的骨关节炎(osteoarthritis,OA)治疗的关键是对早期软骨损伤或退变的有效干预。软骨组织工程是目前的研究热点,自身软骨前体细胞(chondrogenic progenitor cell,CPCs)可能为软骨修复带来希望。纤连蛋白(fibronectin,FN)作为细胞外基质,可与工程化载体Pluronic F-127复合,成为具有潜在临床应用价值的可注射型FN凝胶。课题组前期关于组织工程软骨构建的研究表明,中药威灵仙能发挥类生长因子的作用,促进软骨细胞增殖、Ⅱ型胶原及蛋白多糖的分泌及TGF-β1的表达,有效帮助解决软骨细胞作为种子细胞的瓶颈,因此我们考虑威灵仙能否促进体外培养的软骨前体细胞增殖并发挥促软骨再生的效应。本研究旨在研制一种新的具有潜在临床应用价值的可注射型FN/Pluronic F-127水凝胶,并探讨该凝胶以及威灵仙能否促进CPCs增殖以修复软骨损伤的影响,同时试图阐明其可能的作用机制。二、方法(1)从小鼠的膝关节软骨中分离出CPCs并鉴定。(2)在各种浓度(0,50,100,150 or 200 μg/ml)的威灵仙下培养CPCs和CCs,CCK8实验筛选出最佳威灵仙浓度。(3)在各种浓度(0,10,20,30 or 40 μg/ml)的 FN 下培养 CPCs 和 CCs,CCK8 实验筛选出最佳FN浓度。(4)加入抗整合素α5β1抗体阻断整联蛋白α5β1信号,分别通过EdU实验、CCK8实验、Western blot印迹,transwell实验、划痕实验,28天的细胞分化实验以及RT-PCR检测了软骨前体细胞增殖、迁移、分化过程中整合素α5β1通路的作用。(5)混合的PluronicF-127和可溶性FN(1:1,v/v)作为新型可注射水凝胶。将小鼠分成未经前交叉韧带横断处理的组(假手术组和假手术与FN/Pluronic组)和前交叉韧带横断处理的组(OA组、OA+FN/Pluronic组和OA+Pluronic组),对软骨进行的不同处理,通过对CD105和CD166阳性细胞的组织学评分,软骨强度生物力学分析,胶原蛋白、FN含量和动态分布来测定FN对早期OA软骨修复的作用。三、结果(1)体外培养的来自于全层软骨的细胞群,经过7天培养后使用倒置相差显微镜观察,第一代细胞呈梭型或成纤维细胞样。单层排列并保持稳定形态。大多数软骨前体细胞表达特异性细胞标志物:Notch-1,integrin α5β1,软骨特异性转录因子SOX-9和骨和软骨发育的转录因子RUNX-2。也表达特异性干细胞表面抗原:CD105(阳性率94.30%)与CD166(阳性率95.11%)。造血干细胞来源的表面抗原及白细胞共同表面抗原阴性。(2)使用100,150 or 200 μg/ml威灵仙提取物处理的CCs培养48h后相对于无处理组和50μg/ml威灵仙组增殖明显增加(p<0.05),在100 μg/ml时达到最高,而后随浓度增高进入平台期。威灵仙对CPCs的增殖无明显作用。(3)使用20,30 or 40 μg/ml纤连蛋白处理的CPCs相对无处理组增殖明显增加(p<0.05),在20 μg/ml时达到最高,而后随浓度增高进入平台期。所以选择20 μg/ml为细胞增殖最适浓度用于后续实验。纤连蛋白对软骨细胞的增殖无明显作用。(4)增殖:与对照组相比,FN组对CPCs增殖有明显促进作用(514±14.2vs.381±12.5,p<0.05);相对于FN组,添加FN和整合素α5β1抗体组细胞有丝分裂明显抑制(362±13.1 vs.514±14.2,p<0.05)。迁移:与对照组相比,加FN组每个视野平均细胞数(±方差)在12h和24h时分别增加到(153±4.2)和(256±6.2)(p<0.05);与FN组相比,加FN和整合素α5β1抗体组细胞迁移明显抑制(p 0.05)。28天细胞分化实验:无论是否整合素α5β1通路被阻断,一型胶原在三组中表达无差异。与FN组相比,二型胶原和聚集蛋白聚糖在加纤连蛋白和整合素α5β1抗体组明显表达下降。(5)HE染色:假手术组及假手术FN/Pluronic处理组中软骨表面平整光滑。在OA组和OAFN/Pluronic处理组中,滑膜细胞增殖,炎性细胞浸润,软骨退行性改变。在OA FN/Pluronic处理组中可见表层存在软骨面微小颤动,但是有软骨或软骨前体细胞增多。在OAPluronic处理组中表面软骨层可见不连续。番红固绿染色:OA组小鼠有蛋白聚糖的丢失(番红染色变淡),软骨面粗糙不连续,软骨细胞层有一定缺失。OA FN/Pluronic处理组可见软骨面微小颤动但无软骨缺失或不连续。OAPluronic处理组垂直裂隙延伸至软骨表面以下(<25%)。二型胶原免疫组化染色:假手术组和假手术FN/Pluronic处理组二型胶原染色强阳性,都无明显改变。OA+FN/Pluronic处理组显示FN/Pluronic有保护作用,染色阳性较强,而OA 组显示软骨面明显染色减弱(88.8±5.9/45.6±6.2 vs.25.6±4.7,p<0.05)。OA+Pluronic 处理组阳性细胞数明显低于 OA+FN/Pluronic F-127 处理组(45.6±6.2 vs.88.8±5.9,p<0.05)。OARSI评分:OA +FN/Pluronic F-127处理组明显抑制关节退变(2±0.62,p<0.05),而OA无处理组评分最高。OA+Pluronic处理组与OA无处理组相比评分下降(6±0.73 vs.10±0.58,p<0.05)但仍高于 OA+FN/Pluronic 处理组(6±0.73 vs.2±0.62,p<0.05)。生物力学:OA+FN/Pluronic F-127处理组中软骨的强度比其他两个OA组中的软骨的强度要高,但仍然低于假手术组的水平。软骨前体细胞的动态分布:免疫荧光:术后两周,OA无处理组和OA+FN/PluronicF-127处理组的软骨表层的2-3层CD105阳性细胞均匀排列。而术后6周OA+FN/PluronicF-127处理组软骨表层聚集更多的CD105阳性细胞达4-5层。但是OA无处理组中,在损伤位点CD105阳性细胞明显减少。定量分析OA+FN/Pluronic F-127处理组术后2周表层阳性细胞比例从41.8%(标准差7.2)增加至87.5%(标准差8.7)。但是,OA无处理组从2周至6周无明显变化(42.6%to 32.7%,p=0.16)。流式细胞实验:使用贯序链霉蛋白酶/胶原酶消化法从软骨表面分离表层细胞也同样发现CD105和CD166高表达在OA+FN/Pluronic F-127处理组术后6周(平均阳性细胞率80.9%和 81.6%,p<0.05)。但 OA 组没有明显改变(p =0.20)。western blot实验:与术后2周相比,OA+FN/Pluronic F-127处理组术后6周整合素α5β1表达明显上调,表明关节腔内注射一定浓度的FN/Pluronic F-127水凝胶可通过上调整合素α5β1来缓解关节损伤。但OA无处理组在术后2周和6周无明显差异。FN免疫荧光:外源性纤维蛋白作为没有细胞的致密区域出现,在早期的OA模型中免疫荧光显示FN强染色。四、结论本研究发现FN通过整合素α5β1信号通路增强了 CPCs的增殖、迁移和成软骨分化。关节腔内注射研制的新型可注射型FN/Pluronic F-127水凝胶可以通过上调整合素α5β1的表达来修复软骨损伤,可以为软骨退变或损伤的治疗提供一定的理论依据。