子宫内膜异位症(endometriosis, EMS)性不孕是指由EMS导致的不孕症,其发病率高,体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)技术是帮助此类患者获得妊娠的有效治疗手段。但是研究表明EMS患者接受IVF-ET治疗,所获得的胚胎质量较差,胚胎种植率及妊娠率均低于输卵管或男方因素等行助孕治疗的患者,目前对于相关机制的研究结论尚存在争议,具体原因不明。一方面,近期有研究结果表明,EMS患者存在体重指数(body mass index, BMI)偏低的现象,并且BMI下降的程度可能与EMS的病情程度有关,即随患者EMS病情的加重BMI呈现下降趋势。由于影响人体BMI的最重要因素是脂肪组织,所以EMS患者可能体内存在脂肪及糖代谢异常。另一方面,目前已有较多学者的研究结果证实,瘦素(leptin)做为脂肪组织释放的关键性脂肪代谢因子,不仅通过控制人的食物摄取等生物学行为而参与体重调节,而且其分泌水平受血糖、胰岛素、体重等变化的调节。另外,已有研究证实,瘦素在EMS患者血清、卵泡液及腹腔液中的表达水平异常。因此,瘦素不仅与体重调节存在密切的关系,而且可能参与了EMS的发病,影响了受精卵的发育、子宫内膜容受性及胚胎植入等过程。由此可见,EMS患者体内异位内膜的生长,可能与瘦素参与调节的内分泌及糖脂代谢的异常有关,并且两者相互作用,可能导致了EMS患者自然妊娠及IVF助孕的妊娠率下降。目前关于EMS性不孕患者在IVF超促排卵周期中BMI与EMS病情及IVF助孕结局的研究较少,并且国内尚未见关于EMS患者糖脂代谢及内分泌代谢的变化研究,瘦素在其中的作用机制尚不明了。本研究首先通过对接受IVF-ET助孕治疗的EMS患者临床资料进行对比分析,了解EMS患者病情程度及助孕结局与患者BMI之间的相关性。另外,研究收集了EMS患者的静脉血、卵泡液及颗粒细胞,分析瘦素及血糖、血脂及性激素水平,颗粒细胞瘦素mRNA及其受体mRNA的表达和磷酸化信号传导与转录活化因子3(p-STAT3)、代谢相关酶GLUT4(葡萄糖转运蛋白-4)的含量,初步探索EMS性不孕患者瘦素水平与糖、脂肪代谢异常及IVF助孕结局的关系,并进一步探讨该病的发病机制及其接受助孕治疗妊娠率下降的内在机理,为改善EMS患者卵子质量,提高辅助助孕的妊娠率提供理论依据和实验基础。第一章 子宫内膜异位症性不孕患者体重指数与体外受精-胚胎移植周期临床结局的关系[研究背景]EMS是子宫内膜组织生长于子宫腔被覆黏膜以外的身体其他部位的一种疾病,是始于细胞水平,以盆腔痛和不孕为主要临床症状的持续性疾病,虽为良性疾病,却表现着侵蚀性和复发性的“恶性”生物学行为。由其引起的严重痛经,给患者带来难以忍受的痛苦,而与其并发的不孕症,更是给患者及其家庭造成精神、心理及经济上的巨大压力,严重影响广大妇女的身心健康和生活质量。EMS已成为妇产科常见病、多发病、现代病,随腹腔镜在其诊断中的应用,统计的发病率仍在上升。另外,近年来的研究发现EMS患者的BMI偏低,且接受IVF或卵胞浆内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)助孕治疗的EMS患者妊娠结局较差。但是在子宫内膜异位症性不孕领域,以往的研究并未确立EMS与患者BMI之间的关系,尤其关于接受IVF助孕治疗的EMS患者相关研究较少,结论存在争议。[研究目的]本研究中按照纳入标准,分析助孕周期中的轻度EMS患者、中重度EMS患者和排除了EMS的对照组患者的临床及实验室资料,了解EMS对患者BMI的影响及BMI与临床助孕结局之间的关系,及EMS对患者卵巢反应性的影响,其BMI是否与妊娠率、流产率之间有一定相关性。[研究方法]1.研究对象：经医院伦理委员会批准及患者知情同意,对2011年1月至2012年9月在北京大学深圳医院生殖医学科第一次行IVF或(和)ICSI治疗的患者进行病历对照研究,共261例。全部患者在接受助孕治疗前的2年内经过腹腔镜或者开腹手术(妊娠相关手术除外),根据术中情况及术后的病理学检查结果,按照美国生育协会ASRM (the American Society of Reproductive Medicine)进行分期并分组：(1)对照组：无子宫内膜异位症组(n=157)；(2)实验组1：Ⅰ-Ⅱ期轻度子宫内膜异位组(n=57)；(3)实验组2：Ⅲ-Ⅳ期中重度子宫内膜异位症组(n=47)。2.研究方法：所有患者均采用长方案垂体降调节,月经周期3-8天连续使用重组卵泡刺激素(Gonal-F 75IU/支 Serono公司),当至少2个卵泡直径≥18mm时停止注射rFSH,注射重组人绒毛膜促性腺激素(Ovidrel 250ug/支Serono公司)250ug后36±1h经阴道取卵,IVF/ICSI受精后48-72h,选择1-3个优良胚胎移植。使用黄体酮注射液40-60mg/d,或加用HCG进行黄体支持。研究各组间IVF治疗中及治疗后的一般情况、促性腺激素(gonadotropin, Gn)总用量、Gn天数、HCG日E2水平、获卵数、移植胚胎数、患者体重指数及临床结局之间的关系。3.统计学方法：应用SPSS13.0软件包处理。三组间计量资料的比较采用方差分析,其中方差不齐的采用Welch法,方差齐的组间比较采用LSD法,结果数据以均数±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义。三组间率的比较采用x2检验或FISHER确切概率法, P<0.05为差异有统计学意义。[研究结果](1)三组患者一般情况的比较发现,三组在年龄、不孕年限、不孕类型(原发/继发不孕)等方面均无显著性差异(P>0.05)(2)三组患者IVF/ICSI周期临床资料的比较中发现：实验组2与对照组相比,Gn用量增加(39.53±18.33 vs 32.51±13.15只安瓶rFSH),而HCG日E2水平(1873.12±1313.26 vs 2428.88±1308.18 pg/ml)、获卵数(8.15±4.68 vs 11.17±6.46个)、移植胚胎数(1.98±0.57 vs 2.21±0.46个)均减少,有统计学差异(P<0.05)。(3)三组患者BMI与IVF/ICSI周期妊娠结局的比较：实验组2的BMI显著低于对照组(19.63±1.95 kg/m2 vs 21.40±3.02kg/m2),差异有显著性(P<0.01)；实验组1的BMI值也较对照组偏低(20.27±2.11 kg/m2 vs 21.40±3.02kg/m2),但无统计学意义(P>0.05)。实验组1组与对照组临床妊娠率差异无统计学意义(36.8%vs 38.2%)(P>0.05)；实验组2与正常对照组患者及实验组1相比临床妊娠率均下降(19.1 vs 38.2%：19.1 vs 36.8%),有统计学差异(P<0.05)。[研究结论](1)EMS性不孕患者的BMI：中重度EMS组患者的BMI显著低于对照组(P<0.01),而轻度EMS组患者的BMI值也较对照组偏低,但无统计学意义(P>0.05),不除外与我们的研究中纳入的EMS组的样本量较少有关。因此,本研究结果提示在接受IVF治疗的不孕症人群中,EMS患者的BMI与排除了EMS的对照组相比偏低。且BMI下降程度随病情程度加重而有加重的趋势。国内尚未见类似报道。(2)EMS性不孕患者的BMI与助孕结局：中重度EMS患者接受IVF/ICSI助孕的妊娠结局较差, 且EMS患者BMI变化的趋势与IVF妊娠结局变化的趋势基本一致,即中、重度EMS组的体重指数及临床妊娠率均低于轻度EMS组和对照组,而轻度EMS组的体重指数及临床妊娠率与对照组差异无显著性。因此EMS患者的BMI可能是影响妊娠结局的相关因素。另外,在EMS患者,尤其是中重度EMS患者在进行助孕治疗前,通过运动及饮食等途径增加患者的BMI,可能会改善其助孕结局。(3)EMS与卵巢反应性：中重度EMS不孕患者表现为卵巢储备功能及其对促排卵药物的反应性下降,获得卵子数量减少。该因素也是参与导致中重度助孕结局的下降的原因之一。第二章IVF-ET周期中子宫内膜异位症性不孕患者瘦素、糖脂代谢水平的变化[研究背景]EMS性不孕症严重影响广大妇女的身心健康和生活质量。目前发病机制尚不明确,我们在第一章的研究结果中发现,接受IVF-ET助孕治疗的子宫内膜异位症性不孕的妇女中,中重度EMS患者体重指数及助孕结局与轻度EMS和正常对照患者相比,均呈现下降趋势。所以EMS的发病及病情进展、导致不孕可能与患者体内的糖脂代谢和内分泌代谢异常有关。[研究目的]本章着重分析EMS性不孕接受助孕治疗的患者,取卵日血清及卵泡液中的血糖、血脂、性激素、胰岛素及瘦素水平的变化情况,并结合患者腹围、臀围及BMI等体格检查指标,初步掌握促排卵治疗后糖脂代谢及内分泌水平与EMS病情的关系以及瘦素在EMS分期中的作用。[研究方法](1) 研究对象：经医院伦理委员会批准及患者知情同意,选取2013年07月至2013年11月期间在北京大学深圳医院生殖医学科接受第一次IVF或ICSI治疗的患者进行了研究,共21例。全部患者在接受助孕治疗前的2年内接受过腹腔镜或者开腹手术(妊娠相关手术除外),根据术中情况及术后的病理学检查结果,按照ASRM分期并分组：(1)对照组：无子宫内膜异位症的对照组(n=7)；(2)实验组1(轻度子宫内膜异位组)：Ⅰ～Ⅱ期组(n=7)；(3)：实验组2(中重度子宫内膜异位症组)：Ⅲ～Ⅳ期组(n=7)。(2) 促排卵治疗：所有患者均进行促排卵治疗(同第一章的研究方法)。(3) 体格检查指标测定：取卵日由专人测量身高、体重、腹围、臀围；计算BMI=体重(kg)／身高(m)。(4) 血清和卵泡液中胰岛素、血糖、血脂及性激素含量的测定：取卵日收集所有患者空腹血清及卵泡液,采用自动化生化分析仪测定上述指标。(5) 血清和卵泡液中瘦素含量的测定：取卵日收集所有患者空腹血清及卵泡液,离心后留取并等量分装,置入-70℃冰箱待测。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)检测瘦素水平。(6) 统计方法：采用SPSS13.0软件,计量资料用方差分析进行比较,方差齐的组间比较采用LSD法,其中方差不齐的采用Welch法,P<0.05为差异有统计学意义。相关性采用双变量相关分析法,P<0.05为差异有统计学意义。[研究结果](1) 三组患者体格检查指标的比较：身高、体重、臀围、BMI的差异均无统计学意义(P>0.05),对照组的腹围与实验组1差异有统计学意义,高于实验组(88.14±8.75 vs 75.86±7.10cm) (P=0.022)(2) 三组患者血清胰岛素、血糖、血脂及性激素的比较：血清血糖、孕酮、睾酮、甘油三脂、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白的水平差异无统计学意义(P>0.05)。实验组1的胰岛素和胆固醇水平低于对照组；实验组2的黄体生成素水平高于对照组；实验组2的血清雌二醇浓度低于实验组1和对照组(P<0.05)。(3) 三组患者卵泡液胰岛素、血糖、血脂及性激素的比较：三组卵泡液血糖、甘油三脂、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、黄体生成素水平的差异均无统计学意义(P>0.05)。实验组1和实验组2的胰岛素水平均低于对照组,差异有统计学意义(3.21±1.73 vs 7.03±4.50 uIU/ml; 2.95±2.52 vs 7.03±4.50mmol/l) (P=0.046);实验组2的卵泡液睾酮水平高于对照组(P<0.05),差异有统计学意义。(4) 三患者血清和卵泡液中Leptin含量的比较：血清瘦素水平的差异均有显著性,实验组2>实验组1>对照组(3667.89±495.18 vs 2286.61±304.18 vs 1080.70±546.37 pg/ml) (P<0.01);实验组2的卵泡液瘦素水平高于实验组1和对照组1906.71±373.56 vs 1102.96±159.67 pg/ml; 1906.71±373.56 vs 874.67±423.64pg/ml) (P<0.01);(5) 三组患者血清和卵泡液中Leptin与胰岛素水平的相关性：血清瘦素与血清胰岛素水平有负相关趋势,但是无统计学意义,P=0.092；卵泡液瘦素与卵泡液胰岛素水平呈负相关,Pearson相关系数为0.46,P=0.034,[研究结论](1)三组患者在BMI、臀围等体格检查指标的差异无统计学意义的情况下,EMS性不孕患者IVF周期中取卵日的血清瘦素水平均有显著性差异(P<0.01),对照组瘦素水平最低,其水平随EMS病情及分期的加重而增加。促排卵药物可能通过诱导EMS患者瘦素的过度分泌,导致卵子及胚胎质量下降。并且EMS病情越重,其瘦素分泌量越大,对卵子及胚胎的不良影响越严重。(2)三组患者在BMI、臀围等体格检查指标的差异无统计学意义的情况下,中重度EMS组与轻度EMS组和对照组的卵泡液瘦素水平有显著性差异,中重度EMS组的瘦素水平显著高于轻度EMS组和对照组。卵泡液中适宜的瘦素水平对于卵子发育非常重要,所以在接受IVF治疗的EMS患者中,超生理需要量的卵泡液瘦素水平可能造成颗粒细胞的功能损伤及不同程度的卵泡成熟障碍,导致卵子及胚胎质量下降,从而影响了EMS妇女的胚胎着床率和妊娠率。(3)接受IVF治疗的EMS性不孕患者卵泡液leptin和胰岛素水平呈负相关性,相关系数r=0.46,P<0.05；血清中瘦素和胰岛素水平也呈现负相关趋势,但是无统计学意义,不除外与我们实验中的样本量较少有关。因此,在接受IVF治疗的EMS不孕的患者中,仍然存在瘦素-胰岛素反馈通路。因此,EMS患者体内异常升高的血清和卵泡液瘦素水平,可导致胰岛素分泌的过度抑制,从而可能影响胰岛素参与的糖脂代谢过程,导致EMS患者的糖脂代谢紊乱。(4)轻度EMS组血清TG含量高于对照组,余各项血脂水平在三组间均差异无统计学意义,各组的卵泡液脂类水平也无差异。尽管本研究发现EMS患者的大部分血脂的表达水平正常,但结论确立需要扩大样本量等进一步研究。但目前尚未见关于EMS患者卵泡液脂类成分的相关研究。第三章子宫内膜异位症性不孕患者的颗粒细胞瘦素及其受体表达与STAT信号通路的关系[研究背景]EMS导致不孕的机制尚未完全明确,并且不同期别的EMS可能导致不孕的原因不同,主要病因包括：(1)盆腔解剖结构改变导致配子运输障碍；(2)卵巢功能异常；(3)子宫内膜容受性下降；(4)受精异常；(5)免疫及炎症反应异常等。[研究目的]进一步分析不同期别的EMS性不孕患者卵巢颗粒细胞瘦素对卵子质量影响的作用机制,明确患者颗粒细胞是否存在糖脂代谢的紊乱成为我们本章研究的核心内容。本部分研究检测颗粒细胞瘦素mRNA及瘦素受体(ob-R) mRNA的表达和磷酸化STAT3、糖代谢关键酶葡萄糖转运蛋白-4(gluscose transporter 4, GLUT4)的含量,深入分析EMS患者瘦素水平与糖代谢异常对EMS发病的关系,探讨瘦素在调节EMS患者生殖力方面的作用,以期进一步揭示患者体重异常及助孕治疗中低植入率和低妊娠率的内在机理。[研究方法](1) 研究对象：同第二章“研究对象”(2) 促排卵治疗：所有患者均进行促排卵治疗(同第一章的“研究方法”)。(3) 标本收集：取卵日收集EMS患者及对照组患者的卵泡液,术中选取优势卵泡的卵泡液(卵泡直径>=17mm,卵泡液清亮无血染且均拣出卵子的卵泡液),离心,提取取颗粒细胞层,-70℃冰箱保存。(4) 颗粒细胞Leptin mRNA、ob-R mRNA含量的测定：取各样本颗粒细胞,采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)法测定Leptin mRNA、ob-R mRNA水平,对比对照组与各EMS组mRNA含量的差异。(5) 颗粒细胞中p-STAT3,GLUT4含量的测定：取各样本颗粒细胞,提取蛋白,采用免疫印迹法(Western blotting)测定p-STAT3,GLUT4的蛋白水平,对比对照组与各EMS组蛋白含量的差异。(6) 统计方法：运用SPSS13.0软件,采用oneway ANOVA进行数据分析。首先分析在内异症组及正常女性颗粒细胞中瘦素mRNA及ob-RmRNA的表达差异,并分析它们的表达差异与内异症的临床分期关系,数据以均数士标准差(x±S)表示,P<0.05为差异有统计学意义。第二,将p-STAT3,GLUT4含量的累积光密度值,以内参照为标准,取相对积分值,所得结果。数据以均数士标准差表示,方差齐的组间比较采用LSD法,其中方差不齐的采用Welch法,P<0.05为差异有统计学意义。[研究结果](1)正常对照组、轻度EMS组和中重度EMS组卵巢黄素化颗粒细胞瘦素mRNA及OB-RLmRNA水平的比较：三组中的每组病例各7例,颗粒细胞均有瘦素mRNA及OB-RLmRNA的表达。以GAPDH作为内参照,取相对积分值,分析各实验组间卵巢黄素化颗粒细胞表面瘦素mRNA及、OB-RLmRNA水平表达水平的差异,结果显示三组间卵巢黄素化颗粒细胞瘦素mRNA及OB-RLmRNA表达水平差异无统计学意义,P>0.05。(2)正常对照组、轻度EMS组和中重度EMS组卵巢黄素化颗粒细胞内p-STAT3水平及GLUT4水平的比较：三组中的每组病例各7例,颗粒细胞分别提取总蛋白,加热变性处理后进行蛋白质电泳,Western blot检测各组颗粒细胞内p-STAT3水平及GLUT4水平,凝胶成像系统测定各泳道积分值,并取相对积分值。三组患者颗粒细胞均有p-STAT3及GLUT4蛋白的表达。p-STAT3水平积分值在各实验组间比较差别均具有统计学意义(p<0.05),中重度EMS组卵巢黄素化颗粒细胞p-STAT3表达水平最高,其次依次为轻度EMS组和正常对照组。正常对照组、轻度EMS组和中重度EMS组卵巢黄素化颗粒细胞内GLUT4水平积分值各实验组间比较差别具有统计学意义(P<0.05),对照组卵巢黄素化颗粒细胞GLUT4的表达水平最高,而轻度EMS组和中重度EMS组(图3-2,各实验组病例数n=7)GLUT4表达均较低,EMS两组间的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。[研究结论](1) EMS性不孕患者颗粒细胞表达的瘦素mRNA水平及OB-RLmRNA水平与正常对照组的差异无显著性,表明EMS患者卵巢颗粒细胞功能的变化,可能不是通过调整其瘦素及其受体水平的变化来实现的。(2) EMS性不孕患者经过超促排卵治疗后,瘦素信号转导通路上的重要蛋白,p-STAT3的含量与对照组相比明显上调,且随EMS病情加重,有增加的趋势。因此,在EMS患者的颗粒细胞中p-STAT3水平的升高,意味着瘦素的下游信号转导通路信号的放大,从而导致颗粒细胞功能的受限或损伤。(3)正常对照组、轻度EMS组和中重度EMS组卵巢黄素化颗粒细胞内GLUT4水平积分值各实验组间比较差别具有统计学意义(P<0.05),其中对照组卵巢黄素化颗粒细胞中GLUT4的表达水平最高,而轻度EMS组和中重度EMS组的GLUT4表达量均较低,两组间表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。由此可以看出,EMS组颗粒细胞的葡萄糖转运及摄取、利用能力可能较无EMS的患者出现明显下降。该机制可能是导致EMS患者颗粒细胞分泌功能的下降和卵母细胞成熟障碍及卵子质量下降的因素之一。另外,结合我们第二部分的研究结果进行分析,中重度EMS组和轻度EMS组患者的卵泡液中的胰岛素水平的变化趋势与颗粒细胞中GLUT4的变化趋势相同。即较对照组均减少,而EMS两组间无差异。该结论再次证明了胰岛素通过激活或调整GLUT4调控糖代谢过程。