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植物液泡型 Na+/H+逆向运转体利用液泡膜 H+-ATPase(V-ATPase)和液泡膜H+-PPiase(V- PPiase)产生的跨膜质子电化学梯度将液泡基质中质子顺电化学梯度运出液泡,同时将胞质中的 Na+逆浓度梯度运入液泡内积累。这不仅能够降低胞质内的 Na+以维持胞质正常的 K+/Na+比值,还可以有效利用储存在液泡中的 Na+作为渗透剂。过量表达液泡型 Na+/H+逆向运转体的转基因拟南芥、番茄等的耐盐性明显提高,说明液泡型Na+/H+逆向运转体在植物的耐盐性中有重要作用。 虽然棉花是较耐盐碱的作物之一,在盐碱地区有大面积种植,已取得良好的经济效益和社会效益。但棉花的耐盐能力仍然有限,常规品种一般耐盐能力只有 0.3%。所以,要在盐碱地广泛种植棉花,必须进一步提高棉花的耐盐能力。国内外在这方面做了大量研究。然而涉及分子水平的研究还不多,对 Na+在棉花液泡内的积累与否还有争议。因此本研究分别以耐盐棉花品种枝棉 3 号(ZM3)和盐敏感品种中棉所 12 号(ZMS12)、中棉所 17 号(ZMS17)为试材,对棉花液泡型逆向运转体进行基因克隆、序列比较、表达分析和功能鉴定,并对其与棉花不同品种的耐盐性关系进行了初步研究,主要结果如下: 1. 利用同源序列设计兼并引物,通过 RT-PCR 的方法从陆地棉(Gossypiumhirsutum)枝棉 3 号中克隆到 Na+/H+逆向运转体基因的中间片段,再通过 5’ -RACE 和3’-RACE 分别克隆到 Na+/H+逆向运转体基因的 5’ 片段和 3’片段,拼接后设计特异引物扩增到 Na+/H+逆向运转体基因全长 cDNA,其中包括一个 509 bp 的 5’非编码区、1629bp 编码区和一个 344 bp 的 3’非编码区,编码一个 543 个氨基酸的多肽,分子量约为60,000 kDa。 ～1～<WP=10>吴长艾: 棉花液泡型 Na+/H+逆向运转体基因的分离、功能鉴定及其在耐盐性中的重要作用 2. 同源序列比较发现,棉花 Na+/H+逆向运转体与拟南芥、水稻、野滨藜的液泡型Na+/H+逆向运转体有高度的序列同源性,分别为 79.7%, 77.1% 和 80.6%,而与动物、拟南芥和大肠杆菌质膜型 Na+/H+逆向运转体的序列同源性很低,分别约为 13%,7.9%和 5.9%,因此推断我们获得的全长 cDNA 的编码产物是液泡型 Na+/H+逆向运转体,命名为 GhNHX1。聚类分析也表明 GhNHX1 与拟南芥、水稻、野滨藜和酵母液泡型 Na+/H+逆向运转体的亲缘关系很近。 3. 跨膜结构分析表明,GhNHX1 氨基端有 9-12 个序列保守的跨膜结构域(TM),而羧基端尾部是亲水的。TM3 有非常保守的氨氯吡嗪咪的结合域 ( LFFIYLLPPI94 )。 85TM5 和 TM6 并没有完全跨过液泡膜,具报道这两个跨膜结构域与 Na+结合,是液泡型Na+/H+逆向运转体活性的重要结构域。 4. Northern 表达分析表明 GhNHX1 受盐胁迫强烈诱导表达,以子叶(叶)中诱导表达水平最高,其次为茎,根中最少。其表达水平随 NaCl 处理浓度的增加而增加,但随诱导时间的变化不大,说明 GhNHX1 在盐胁迫条件下能够被快速诱导。GhNHX1 也能被 KCl 、LiCl、ABA 和 SA 诱导,说明 GhNHX1 对盐胁迫的非专一性。同时暗示着GhNHX1 受 ABA 和 SA 信号途径的调控,可能是 ABA 信号途径的靶基因。 5. GhNHX1对酵母液泡型Na+/H+逆向运转体突变体的互补实验表明GhNHX1能部分恢复酵母液泡型 Na+/H+逆向运转体突变体的耐盐性,说明 GhNHX1 可能是通过整合到酵母的液泡膜上才提高其突变体的耐盐性的。GhNHX1 在转基因烟草中过量表达,能使转基因烟草在200 mM NaCl条件下正常生长。用GhNHX1特异探针标记的northern杂交结果说明 GhNHX1 只在转基因植株中表达。对转基因烟草和野生型烟草进行了Southern 分析,表明 GhNHX1 整合到烟草基因组中。而且,GhNHX1 在 T2-4 中较强的表达信号与 GhNHX1 在 T2-4 中的多拷贝数有关。 6. 用花粉管通道法将携带 GhNHX1 基因的正义表达载体和反义表达载体导入生产上推广的棉花品种中棉所 12 号中,T1 代幼苗用 0.5%的卡那霉素抗性筛选,在 456 株幼苗中共获得有卡那霉素抗性的植株 56 株,PCR 鉴定出 45 株,其中 15 株反义转基因植株,30 株正义转基因植株。 7. 盐胁迫处理后,枝棉 3 号(ZM3)和中棉所 12 号(ZMS12)的叶绿素含量降低和丙二醛含量增加,表明两个棉花品种均受到盐胁迫危害。ZM3 的叶绿素含量降低幅度和丙二醛含量增加幅度均明显小于 ZMS12,表明 ZM3 的耐盐性较 ZMS12 强。但是,盐胁迫处理后,两品种的 Na、K、Ca、Mn 离子含量在器官水平上并无明显差异。所 ～2～<WP=11>山东农业大学博士学位论文以,ZM3 较强的耐盐性可能与 ZM3 对 Na+的液泡区域化有关。事实上,Northern 表达分析表明,GhNHX1 在 ZM3 中的表达量显著高于在 ZMS12 和 ZMS17 中的表达,分别是其表达量的 7 倍和 3 倍,表明 ZM3 较强的耐盐性与 GhNHX1 基因的表达有关。8. 从 GhNHX1 中选取 3’端大约 300 bp 的亲水区域构建原核表达载体 pETN 并在大肠杆菌 BL21(DE3)中表达融合蛋白,将强诱导带(多条泳道)切下,溶于 PBS 中获得抗原,免疫家兔, 其抗血清效价为 1:1000。