新疆昆仑雪菊(Kunlun Chrysanthemum)又名雪菊(Coreopsis tinctoria Nuff.),维吾尔名“古丽恰依(Gulqai)”,系菊科(Compositae)金鸡菊属(Coreopsis)一年生草本两色金鸡菊(C.tinctoria)同属近缘植物昆仑雪菊(Kunlun Chrysanthemum)的头状花序,其花期短,野生产量稀少。新疆人们称之为雪菊、天山雪菊、高寒香菊、两色金鸡菊等。新疆昆仑雪菊是生长在新疆昆仑山脉,海拔3000米左右的高寒山区的一种抗高寒菊科类植物,是维吾尔族世代传承下来的一种养生、保健的天然草本植物,具有高效降血脂、软化血管、抑制细菌生长的功效,是国内心血管专家一致评定的治疗冠心病的特殊药食两用植物,是目前新疆唯一与雪莲齐名且具有独特功效的稀有高寒野生植物。近年来,关于新疆昆仑雪菊的有效组分分析及生物活性已经成为研究热点,但是市场产品较单一,基本以“高档茶”形式出现。本文从提升昆仑雪菊深加工水平出发,以新疆昆仑雪菊花为原料,围绕昆仑雪菊多糖(KCCP)、总黄酮(KCTF)和原花青素(KCPC)这三种活性成分,系统研究昆仑雪菊中这三种组分的提取工艺、分离纯化及生物活性并进行分析比较,这对规范市场雪菊资源、开拓高附加值综合开发利用途径及促进雪菊资源在食品和药品上的应用有重要的理论指导和现实意义。本论文分别对复合酶-超声辅助提取昆仑雪菊多糖、超高压法提取昆仑雪菊总黄酮和超声波法提取昆仑雪菊原花青素的提取工艺进行了优化,以DPPH?自由基、?OH自由基和总抗氧化能力三个模型分析了昆仑雪菊多糖、总黄酮、原花青素的体外抗氧化能力并进行了分析比较;以昆明种健康雄性小鼠为受试动物,通过测定血清、肝脏和肾脏匀浆的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)含量和总抗氧化力(T-AOC)值分析昆仑雪菊多糖、总黄酮、原花青素体内抗氧化能力并进行分析比较;采用滤纸片法研究了昆仑雪菊多糖、总黄酮、原花青素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、青霉、黑曲霉及酿酒酵母的抑菌能力,并利用最低抑菌浓度值(MIC)进行了抑菌活性比较;采用四唑盐比色试验法(MTT法)考察了昆仑雪菊多糖、总黄酮、原花青素对肝癌细胞BEL-7404、食道癌细胞Eca-109、鼠肝癌细胞H22、宫颈癌细胞He La等肿瘤细胞增殖抑制作用,并利用半数清除浓度IC50值对三者的肿瘤抑制活性进行比较;通过建立CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型,测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)来评价昆仑雪菊多糖、总黄酮、原花青素的护肝作用并进行比较分析;同时,论文着重研究了昆仑雪菊多糖的分离纯化工艺,分析了单糖组成及相对分子质量分布,并对多糖及其组分的生物活性进行了比较,探究构效关系;基于抗氧化活性的比较结果,论文以果蝇为模型,着重研究了昆仑雪菊原花青素的延缓衰老作用及机制。利用正交试验优化了复合酶-超声辅助提取昆仑雪菊多糖的工艺条件,先在40℃,15min,36k Hz条件进行超声处理,然后加入2.5%复合酶(纤维素酶2.0%,酸性蛋白酶0.5%),在酶解温度55℃、p H 4.5的条件下酶解2.0h,多糖提取率为9.83%,纯度为28.58%。其提取得率比传统回流提取法提高了188.3%,纯度提高了216.2%。以糖含量和体外抗氧化活性为筛选导向,首先用DEAE-52纤维素离子交换柱对昆仑雪菊多糖(100mg)分离纯化得到PI(1mg)和PⅡ(3.7mg)两个组分,然后取主要组分PⅡ(糖含量2%,g/m L)经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱分离纯化得到PⅠ’(0.2%,g/m L)、PⅡ’(0.4%,g/m L)和PⅢ’(0.2%,g/m L)三个组分。DEAE-52纤维素离子交换柱分离纯化昆仑雪菊多糖的最佳条件是:糖液浓度为20 mg/m L时,上样量为5 m L,洗脱液流速为0.5 m L/min;高效离子交换色谱(HPAEC-PAD)分析昆仑雪菊多糖组分PⅡ完全水解产物的单糖组成为:Fuc 1.84%、Rham 14.99%、Ara 14.39%、Gal 35.08%、Glc 15.92%、Xyl 2.21%、Man6.31%、Gal UA 4.17%、Glc UA 2.87%;高效液相色谱HPLC分析昆仑雪菊多糖组分PⅡ分子质量分布在1.7×104~4.4×106之间。以体外抗氧化活性及对肿瘤细胞增殖抑制作用为指标,分析了昆仑雪菊多糖及其组分PⅡ的生物活性。结果表明,抗坏血酸(Vc)、昆仑雪菊多糖、昆仑雪菊多糖组分PⅡ清除DPPH?自由基的IC50值分别为0.02884±0.07601 mg/m L、0.08557±0.1593 mg/m L、1.941±0.1728 mg/m L,清除?OH自由基的IC50值分别为0.07107±0.07437 mg/m L、0.2701±0.05723 mg/m L、6.740±0.07375mg/m L。昆仑雪菊多糖及组分PⅡ对H22、He La和Eca-109细胞的这三种癌细胞增殖都有抑制作用,而且随着药物作用浓度的增加,显示出较好的量效关系。昆仑雪菊多糖对H22、He La和Eca-109细胞增殖抑制的IC50值分别为884.2±0.06069μg/m L、212.8±0.05834μg/m L和497.6±0.05472μg/m L,组分PⅡ的IC50值分别为2211±0.1554μg/m L、1215±0.4279μg/m L和2157±0.1444μg/m L。昆仑雪菊多糖及组分PⅡ对He La细胞增殖抑制作用较强。利用响应面法对超高压法提取昆仑雪菊总黄酮的关键影响因子进行了优化,并建立了回归模型,所得方程拟合性好。最优工艺条件为:以70%乙醇为提取溶剂,提取温度25℃,料液比为1:16,压力340MPa,保压时间3min,粉碎度80目,雪菊总黄酮的提取得率为12.35%,其提取得率比传统回流提取法提高了21.6%,纯度提高了24.3%;然后采用AB-8大孔树脂分离纯化昆仑雪菊总黄酮,纯化的最佳条件为:上样液浓度1.04mg/m L、p H 4、上样流速3BV/h,用5 BV的70%乙醇以2BV/h流速洗脱昆仑雪菊总黄酮的纯度最高,达到52.43%,而纯化前昆仑雪菊总黄酮的纯度为28.12%,提高了86.5%;以IC50值为考察指标,发现超高压法提取所得总黄酮的抗氧化性强于回流提取法、超声波提取法。利用响应面法对超声波辅助提取昆仑雪菊原花青素的关键影响因子进行了优化,并建立了回归模型,所得方程拟合性好。最优工艺条件为:乙醇浓度60%,超声功率240W,料液比1:20,浸提时间33 min,超声温度44℃,提取得率为13.29%,比传统回流法提高了29.8%;采用AB-8大孔树脂分离纯化昆仑雪菊原花青素,分离纯化的最佳条件为:上样液浓度1.06 mg/m L、p H=6、上样流速2BV/h,用4 BV的70%乙醇以2BV/h流速洗脱昆仑雪菊原花青素,纯度达到63.76±0.34%(w/w),而纯化前昆仑雪菊原花青素纯度仅为22.68±1.02%(w/w),提高了181%。以半数死亡天数、平均寿命和平均最高寿命等果蝇生存实验指标反映昆仑雪菊原花青素延长果蝇寿命的功效。结果表明,昆仑雪菊原花青素添加量达到0.0067%时雌性与雄性的平均寿命均显著高于相应对照组,平均延寿率分别达到15.19%、16.77%,表明昆仑雪菊原花青素具有延缓果蝇衰老的功效。通过分析果蝇体内生化指标SOD、MDA水平变化初步探讨昆仑雪菊原花青素延缓衰老机制,果蝇体内生化指标分析结果表明,原花青素添加量为0.0201%剂量组的SOD活性较对照组显著提高,而MDA含量却显著降低,表明昆仑雪菊原花青素增强了体内抗氧化酶活性,自由基及时被清除,提高了果蝇体内自由基的清除能力而延缓衰老。昆仑雪菊多糖、原花青素、总黄酮三者均具有清除自由基的能力。清除DPPH?自由基的IC50值分别为0.08557±0.1593 mg/m L、0.01851±0.2434 mg/m L、1.369±0.05184mg/m L,清除?OH自由基的IC50值分别为0.02701±0.05723mg/m L、0.03560±0.06335mg/m L、1.126±0.3418mg/m L,昆仑雪菊原花青素对DPPH?自由基的清除能力最强,而昆仑雪菊多糖对于?OH自由基的清除能力最强。昆仑雪菊总黄酮、原花青素及多糖均可显著提高小鼠血清及肝肾组织SOD及T-AOC活性,降低MDA含量,具有显著的体内抗氧化作用。综合分析实验结果可看出三者抗氧化能力强弱不同,总体来说,以昆仑雪菊原花青素体内抗氧化作用最强,其次是昆仑雪菊总黄酮,昆仑雪菊多糖最弱。昆仑雪菊总黄酮、原花青素及多糖对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌与青霉的抑制作用强弱顺序为:昆仑雪菊总黄酮>昆仑雪菊原花青素>昆仑雪菊粗多糖;昆仑雪菊原花青素与总黄酮对枯草芽孢杆菌与黑曲霉的最小抑菌浓度(MIC)值相同,抑制作用均强于昆仑雪菊粗多糖。昆仑雪菊粗多糖对细菌和酵母菌的最小抑菌浓度(MIC)均大于昆仑雪菊原花青素和总黄酮,即抑菌效果低于昆仑雪菊原花青素和总黄酮。昆仑雪菊总黄酮抑菌性最强。昆仑雪菊多糖、昆仑雪菊总黄酮、昆仑雪菊原花青素对He La细胞增殖抑制作用的IC50值分别为82.23±0.0376μg/m L、133.6±0.1885μg/m L、113.3±0.0862μg/m L,对Eca-109细胞增殖抑制作用的IC50值分别为220.8±0.06542μg/m L、192.0±0.07719μg/m L、260.4±0.06887μg/m L,对H22细胞增殖抑制作用的IC50值分别为169.8±0.05409μg/m L、84.50±0.1245μg/m L、70.96±0.05409μg/m L。表明昆仑雪菊多糖对Hela细胞增殖抑制作用较Eca-109和H22两种细胞强,昆仑雪菊原花青素和昆仑雪菊总黄酮对H22细胞增殖抑制作用较Eca-109和Hela两种细胞强。三者对Hela细胞的增殖抑制能力由强到弱为:昆仑雪菊多糖>昆仑雪菊原花青素>昆仑雪菊总黄酮;对Eca-109细胞的增殖抑制能力由强到弱为:昆仑雪菊总黄酮>昆仑雪菊多糖>昆仑雪菊原花青素;对鼠肝癌H22细胞的增殖抑制能力由强到弱为:昆仑雪菊原花青素>昆仑雪菊总黄酮>昆仑雪菊多糖。昆仑雪菊多糖及昆仑雪菊总黄酮都能诱导He La细胞发生凋亡改变。昆仑雪菊多糖、昆仑雪菊总黄酮、昆仑雪菊原花青素对四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝损伤的保护作用试验结果表明,模型组血清中ALT、AST活性明显升高(p<0.01),说明造模成功。与模型组比较,给药组原花青素(高剂量组)血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平显著降低(p<0.05),其降低ALT和AST水平能力分别是阳性对照(联苯双酯)的1.5倍和2.8倍。表明昆仑雪菊原花青素能够抑制四氯化碳引起的小鼠体内转氨酶活性升高,具有护肝作用。而昆仑雪菊多糖和昆仑雪菊总黄酮却无明显的肝损伤预防作用。