【摘 要】
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目的基因的靶向治疗是近年来抗肿瘤研究的热点,而制备具有高效肿瘤靶向定位能力的药物输送载体是靶向治疗的关键。壳聚糖(chitosan,CS)纳米载体凭借其优良的生物学性能在组织工程载体中备受关注。本研究利用透明质酸(hyaluronic acid,HA)受体CD44在非小细胞肺癌(NSCLC)中的高表达性,制备HA修饰的新型壳聚糖纳米载体,探讨其作为基因靶向递送载体的可行性,为NSCLC的基因靶向治
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目的基因的靶向治疗是近年来抗肿瘤研究的热点,而制备具有高效肿瘤靶向定位能力的药物输送载体是靶向治疗的关键。壳聚糖(chitosan,CS)纳米载体凭借其优良的生物学性能在组织工程载体中备受关注。本研究利用透明质酸(hyaluronic acid,HA)受体CD44在非小细胞肺癌(NSCLC)中的高表达性,制备HA修饰的新型壳聚糖纳米载体,探讨其作为基因靶向递送载体的可行性,为NSCLC的基因靶向治疗提供新的理论依据。方法用CS和三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate,TPP)通过离子凝胶的方法制备壳聚糖纳米粒(chitosan nanoparticles,CS NPs);再将CS NPs包载针对Bcl-2基因的siRNA后制备sCS NPs;将CS NPs和sCS NPs与透明质酸(hyaluronic acid,HA)结合制备CS NPs-HA和sCS NPs-HA。粒度仪检测四种纳米粒的粒径、Zeta电位、分散度(polydispersity index,PDI)等参数;并在连续6天时间内检测其在中性缓冲体系下的稳定性;扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)观察制备的壳聚糖纳米粒的表面结构;用紫外(UV)分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法检测CS NPs及CS NPs-HA对cy3-siRNA的包载能力。MTT实验评估壳聚糖纳米载体CS NPs及CS NPs-HA的细胞毒性,同时分析sCS NPs、sCS NPs-HA对CD44受体高表达的NSCLC细胞系A549细胞增殖能力的影响;流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析sCS NPs、sCS NPs-HA对A549细胞的转染能力;免疫荧光实验检测sCS NPs-HA在A549细胞中的定位以及CD44受体的激活情况;Western Blot实验检测四种壳聚糖纳米粒对A549细胞中Bcl-2基因的抑制作用。建立裸鼠荷瘤模型,通过肿瘤的体积变化评估sCS NPs、sCS NPs-HA及裸cy3-siRNA对肿瘤的抑制作用;同时计算肝、肾、脾指数评价纳米载体的体内毒性;激光共聚焦荧光显微镜观察sCS NPs-HA在肿瘤组织的荧光定位;Western Blot实验检测其对肿瘤组织中Bcl-2基因表达的调控作用。结果本研究所制备的壳聚糖纳米粒的粒径均在100~130nm之间,分散度小于1,说明其具有很好的分散性;且所制备的壳聚糖纳米粒能在6天内维持性状的稳定;扫描电镜结果显示纳米粒形状近似球形;紫外(UV)分光光度法和琼脂糖凝胶电泳结果显示CS NPs与CS NPs-HA对cy3-siRNA的包载能力较强。MTT结果显示CS NPs与CS NPs-HA对L929细胞的细胞毒性较低;sCS NPs-HA可以显著抑制A549细胞的增殖;FCM实验结果显示,sCS NPs-HA对A549细胞具有持续的高转染效率;免疫荧光实验结果显示sCS NPs-HA可以进入A549细胞并定位于细胞质中,CD44受体在HA的诱导下可被激活;Western Blot实验结果显示,sCS NPs-HA实验组对Bcl-2基因的沉默能力明显高于其它组。动物实验结果显示,sCS NPs-HA能够定位于肿瘤组织且有显著抑瘤作用;各组肝、肾、脾指数均无显著差异,说明本研究制备的纳米载体对主要脏器没有明显毒性;Western Blot实验结果显示sCS NPs-HA组中Bcl-2基因的表达明显降低,证明其具有促进肿瘤细胞凋亡的作用。结论本研究制备的HA修饰的包载cy3-siRNA的sCS NPs-HA可靶向定位于肿瘤部位且抑瘤作用明显优于其它治疗组,为NSCLC基因靶向治疗的临床应用提供了一种新的理论基础。
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