肝素类药物是目前临床应用最为广泛的抗凝剂,主要应用在深度抗凝、透析、外科手术等领域。据不完全统计,2018年全球肝素类药物的销售额突破了 150亿美元。目前肝素主要以猪小肠内壁粘膜为主要原料,通过提取、纯化等一系列制备工艺获得,是目前依然在临床应用的最古老生化药物之一。肝素是一类硫酸多糖药物,与其它多糖一样,肝素有着较大的分子量、一定的分子量分布、不同的糖基组成和硫酸化位置等,它是目前结构最复杂的临床药物之一。然而,其广泛的临床应用和复杂结构体系导致的大量分析问题之间有着巨大的矛盾,这些矛盾一直困扰着药物分析学家们。简言之,目前对其结构的“一知半解”限制了肝素类药物的质量控制、临床用药安全性、新适应症的拓展及基于肝素结构的新药研究与开发的研究。特别是,2007-2008年肝素污染事件的发生,最大程度地激发了该矛盾,暴露了当时肝素类药物有效质量控制方法的缺失问题。此后,肝素类药物分析方法的建立和结构特点研究成为了药物分析领域的热点之一。其中,由肝素制备的低分子量肝素(LMWHs)和具有广泛生物学活性的非抗凝肝素(NACHs)是最具典型特点的两种肝素类物质,它们的结构研究就成为了该领域的焦点。本课题围绕分子量、含量和组成分析方法的建立及肝素、LMWHs和NACHs的结构解析展开了系统的研究工作,简述如下:1、建立和优化肝素分析方法,首先建立针对肝素类药物分子量和含量的分析方法。该方法利用分子排阻色谱与多角度激光散射/示差(SEC-MALS/RI)可以在无需标准品的状态下准确、直接地分析肝素类多糖的分子量、分子量分布和含量。相对常规GPC方法,不再受同系列物质分子量标准品的限制。同时,利用分子排阻色谱与电感耦合质谱联用(SEC-ICP-MS)对肝素的阳离子进行定性定量分析,实现肝素类药物等酸性多糖的准确分子量和含量有效校准,是现有GPC方法的重要补充和提高。接着我们利用亲水间相互作用色谱质谱联用(HILIC-MS)建立了一种肝素二糖组成分析方法。该方法有极高的分辨率,可以将常规和罕见的肝素类药物结构单元进行有效的分离和鉴定,包括常规二糖、抗凝活性相关的3-O-硫酸化四糖、肝素和蛋白连接域四糖及其衍生物等16种结构组成单元。该方法可有效用于肝素类药物结构解析、质量控制、工艺研究等领域。此外,我们还利用等电点聚焦毛细管质谱联用(CIEF-MS)建立了另一种二糖分析方法。该方法是首次基于被测物等电点(pI)差异分离肝素二糖乃至寡糖的反极性CIEF-MS应用,该方法是电荷异质性复杂酸性寡糖的潜在的高灵敏度分析方法。2、对不同动物来源、厂家、生产时期的肝素和依诺肝素钠(临床应用最广泛的低分子量肝素)结构进行深入研究和对比。主要内容包括对不同动物来源、厂家、生产时期的肝素和低分子量肝素的寡糖分布、组成和结构进行系统对比分析。深入地阐述了肝素和低分子量肝素的结构特点,有效地阐述了不同原料来源、生产厂家和生产时期的肝素和低分子量肝素结构差异与原料来源、厂家、生产时期以及抗凝活性之间的关系。3、对非抗凝肝素结构进行了深入的研究。主要内容包括综合利用二糖分析方法、top-down和bottom-up序列分析手段详细阐明了由抗凝肝素制备产生的非抗凝肝素的结构特点和差异。同时,SPR研究显示可与几种不同的重要蛋白因子有不同的结合能力,该结果显示了广泛的非抗凝肝素的潜在临床应用。本课题中肝素类药物分析方法的建立和应用,完善或拓展了肝素产品的质量控制方法。对肝素、低分子量肝素和非抗凝肝素的结构特点进行深入阐释,为肝素类药物的生产、工艺优化、质量控制、新适应症拓展和新药开发提供了坚实的理论基础。