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宝丹酮是一种重要的蛋白同化雄性激素类固醇,可以稳定、持续地增长肌肉和力量,现在主要由1,4-雄烯二酮(1,4-Androstenedione,ADD)通过化学法合成。生物转化法与化学合成宝丹酮相比,具有转化条件温和,环境污染小,副产物少等优势。但由于合成宝丹酮的17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD)很少被鉴定或者已被鉴定的17β-HSD不具有催化17β-还原反应的活性,导致了对酶的利用率较低,因此需要筛选具有更高活性的17β-羟基类固醇脱氢酶。本论文对多种不同来源的17β-HSD进行了分析和筛选,获得了具有较高17β-还原活性的重组酶HSDBo,在高效积累甾体药物中间体(ADD)的宿主中表达,以及构建了辅酶自循环体系,实现了从简单易得的原料植物甾醇到甾体激素药物宝丹酮的一步转化。(1)本研究首先对17β-羟基类固醇脱氢酶基因进行了筛选,根据其氨基酸序列,进行了同源性分析和序列比对。分别选取了来源于真菌和细菌的7种不同17β-HSD,在大肠杆菌中进行了异源表达。经SDS-PAGE验证,发现重组蛋白均可成功表达。进一步考察了各个重组17β-HSD对底物ADD的转化情况。发现重组酶HSDBo的比酶活最高,为HSDCl的2.27倍,结果表明HSDBo具有更高的催化潜力。(2)对HSDBo酶学性质的研究,发现HSDBo的最适pH为7.5,最适温度为37℃,以及为非金属离子依赖性的酶;对17β-HSD的辅酶依赖型进行了鉴定,发现在ADD还原生成宝丹酮的过程中,NADPH为HSDBo的最适辅酶。(3)将新金色分枝杆菌来源的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDHmn)与HSDBo串联,构建了共表达重组菌M.neoaurum JC-12/pMV261-HSDBo-G6PDHmn,并对转化过程胞内辅酶水平进行测定,发现在共表达辅酶之后,胞内NADP+和NADPH基本维持在同一水平,实现了胞内辅酶的循环利用,并提高了宝丹酮的产量,与M.neoaurum JC-12/pMV261-HSDBo相比转化率提高了40.74%。(4)对重组新金色分枝杆菌JC-12/pMV261-HSDBo-G6PDHmn转化植物甾醇合成宝丹酮的条件进行了优化,包括助溶剂、底物浓度、补加葡萄糖,以及在5 L发酵罐中进行发酵。转化的最优条件为,以甲基化-β-环湖精和吐温80为助溶剂、底物浓度10 g·L-1以及在转化第三天补加15 g·L-1葡萄糖,转化生成了3.34 g·L-1宝丹酮,实现了从植物甾醇到宝丹酮的一步转化,为工业上生产宝丹酮提供了一种经济简便的方法。