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在维生素C两步发酵工艺中,第一步为醇糖转化,即在葡糖杆菌作用下D-山梨醇转化为L-山梨糖;第二步为糖酸转化,在普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare,俗称小菌)与其伴生菌(俗称大菌)组成的混合菌系的作用下L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(KGA)。维生素C两步发酵实质上就是D-山梨醇和L-山梨糖的专一性生物氧化过程。阐明这一系列生物氧化过程的生化反应机制对于指导维生素C的遗传育种甚至通过代谢工程构建由山梨醇到KGA的一步发酵工程菌,都具有重要意义。 本课题组已从小菌细胞裂解物中分离得到了催化山梨糖生物氧化的一种关键酶——山梨糖脱氢酶(SDH),该酶能够将L-山梨糖直接转化为KGA;同时构建了小菌的基因文库,并以SDH的抗体筛选文库,分离得到编码SDH的基因(sdh)。 本文在上述工作基础上,首先在大肠杆菌中对山梨糖脱氢酶进行了高效表达,对表达产物进行了纯化,研究了该酶的最适反应温度、最适反应pH值、酶稳定性、米氏反应常数、酶的激活剂和抑制剂、金属离子的激活与抑制作用等重要性质。 研究葡糖杆菌对山梨糖脱氢酶的影响。以氨甲酰化酶基因(hyuC)为报告基因,构建了山梨糖脱氢酶-氨甲酰化酶融合表达载体,在大肠杆菌中可以同时检测到山梨糖脱氢酶和氨甲酰化酶活性;而在葡糖杆菌中,只能检测到氨甲酰化酶活性,未检测到山梨糖脱氢酶活性。质粒稳定性实验和质粒回转实验说明该质粒在葡糖杆菌中稳定存在。由于hyuC基因位于sdh基因下游,融合基因的转录和翻译是从山梨糖脱氢酶到氨甲酰化酶,氨甲酰化酶在葡糖杆菌中表达说明包含山梨糖脱氢酶在内的融合蛋白能够在葡糖杆菌中转录并翻译,山梨糖脱氢酶可能被宿主的酶系降解失活。 通过体外实验也证实葡糖杆菌裂解物对山梨糖脱氢酶具有降解作用。将山梨糖脱氢酶与葡糖杆菌裂解液保温过夜后,通过SDS-PAGE检测到电泳图谱上约60kD和49kD处出现两条明显条带,对这两条带进行蛋白质N-端序列分析,结