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本研究采用细胞培养、RNA干扰、荧光染色及成像分析、蛋白荧光标记、Western blot分析和细胞活性检测等细胞生物学和分子生物学技术和方法,以PC12细胞、SH-SY5Y细胞和小鼠原代神经元为实验对象,通过建立的细胞PD模型,较为系统地研究了PD发生中神经细胞线粒体H2O2介导PTEN/Akt通路经自噬抑制诱导凋亡的分子机理,并探讨了神经细胞Parkin在PD发生中重要性及其生物学意义。结果如下:1神经细胞自噬抑制诱导凋亡在PD发生中作用研究以PC12细胞、SH-SY5Y细胞和原代神经元、或用慢病FLAG-Atg5或EGFP感染的PC12细胞为实验对象,以不同浓度6-OHDA（0-240μM或120μM）、MPP+（0-1 m M或1 m M）或鱼藤酮（0-1μM或1μM）处理24 h。采用Western Blot分析Atg5、LC3、p62、Parkin和Cleaved-caspase-3等蛋白表达,感染Ad-GFP-LC3荧光标记自噬体数量,MTS实验和DAPI染色评估细胞活性和凋亡。结果显示,6-OHDA、MPP+或鱼藤酮均以浓度依赖的方式诱导PC12细胞、SH-SY5Y细胞和原代神经元Atg5、LC3-I/II和Parkin表达以及自噬体数量下降,但p62表达升高;过表达Atg5明显逆转6-OHDA、MPP+或鱼藤酮诱导的PC12细胞LC3-I/II和Parkin下降、p62和Cleaved-caspase-3增加、自噬体数量和细胞活性下降以及凋亡增多。提示:在PD发生中神经细胞呈现自噬抑制依赖的凋亡。2 PD发生中神经细胞PTEN/Akt通路涉及自噬抑制诱导凋亡机理研究以PC12细胞、SH-SY5Y细胞和原代神经元、或用Ad-PTEN-c/s、Ad-myr-Akt和/或Ad-GFP感染的PC12细胞为实验对象,以不同浓度6-OHDA（0-240μM、或120μM）、MPP+（0-1 m M或1 m M）或鱼藤酮（0-1μM或1μM）处理24 h、或雷帕霉素（100 ng/ml）预处理2 h后再用6-OHDA（120μM）、MPP+（1 m M）或鱼藤酮（1μM）处理24 h。采用Western Blot分析PTEN、Akt、Atg5、LC3、p62、Parkin和Cleaved-caspase-3等蛋白表达,免疫荧光分析p-PTEN（Thr366）表达、感染Ad-GFP-LC3荧光标记自噬体数量,MTS实验和DAPI染色评估细胞活性和凋亡。结果显示,6-OHDA、MPP+或鱼藤酮均以浓度依赖的方式诱导PC12细胞、SH-SY5Y细胞和原代神经元p-PTEN（Thr366）、p-Akt（Ser473）和p-Akt（Thr308）水平下降;钝化PTEN明显逆转6-OHDA、MPP+或鱼藤酮诱导的PC12细胞LC3-I/II和Parkin下降、p62和Cleaved-caspase-3增加、自噬体数量和细胞活性下降以及凋亡增多,且过表达Akt强化钝化PTEN逆转的以上事件;雷帕霉素增强过表达Akt的抵抗作用。提示:PD发生中神经细胞PTEN/Akt通路失活涉及自噬抑制依赖的凋亡。3 PD发生中神经细胞氧化应激介导PTEN/Akt通路经自噬抑制诱导凋亡研究以PC12细胞、SH-SY5Y细胞和原代神经元为实验对象,用过氧化氢酶（CAT）（350 U/ml）或Mito-TEMPO（10μM）预处理1 h后再用6-OHDA（120μM）、MPP+（1 m M）或鱼藤酮（1μM）处理24 h。采用Western Blot分析PTEN、Akt、Atg5、LC3、p62、Parkin和Cleaved-caspase-3等蛋白表达,H2DCFDA荧光探针分析细胞内H2O2水平,感染Ad-GFP-LC3荧光标记自噬体数量,DAPI染色评估细胞凋亡。结果显示,CAT或Mito-TEMPO预处理后显著逆转6-OHDA、MPP+或鱼藤酮诱导的PC12细胞、SH-SY5Y细胞和原代神经元PTEN激活及Akt失活、LC3-I/II和Parkin下降以及p62和Cleaved-caspase-3增加,降低6-OHDA、MPP+或鱼藤酮诱导过量H2O2产生,抑制自噬体数量下降和细胞凋亡。提示:PD发生中神经细胞线粒体H2O2过量产生介导PTEN/Akt通路失活导致自噬抑制依赖的凋亡。4神经细胞Parkin在PD发生中重要性及其生物学意义研究以慢病毒sh RNA Parkin、sh RNA GFP、FLAG-Parkin或EGFP感染的PC12细胞为实验对象,用6-OHDA（120μM）、MPP+（1 m M）或鱼藤酮（1μM）处理24 h。采用Western Blot分析PTEN、Akt、Atg5、LC3、p62、Parkin和Cleaved-caspase-3等蛋白表达,H2DCFDA荧光探针分析细胞内H2O2水平,感染Ad-GFP-LC3荧光标记自噬体数量,MTS实验和DAPI染色评估细胞活性和凋亡。结果显示,下调Parkin明显抵抗6-OHDA、MPP+或鱼藤酮诱导的PC12细胞PTEN激活及Akt失活、LC3-I/II和Parkin下降、p62和Cleaved-caspase-3增加、自噬体数量和细胞活性下降以及过量H2O2产生,改善细胞凋亡状态;有趣的是,过表达Parkin加强6-OHDA、MPP+或鱼藤酮诱导的神经毒性。提示:神经细胞Parkin状态在PD发生中对PTEN/Akt通路经自噬抑制诱导凋亡有调节作用,深入的机理有待进一步研究。