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第一部分多重耐药柠檬酸杆菌β-内酰胺酶的基因型研究目的了解安徽医科大学第一附属医院临床分离的多重耐药柠檬酸杆菌的耐药性及其β-内酰胺酶基因型分布,探讨柠檬酸杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制并指导临床合理使用抗生素。方法收集2004年1月至2006年9月安徽医科大学第一附属医院临床分离的柠檬酸杆菌52株,采用琼脂稀释法测定17种抗菌药物对52株柠檬酸杆菌的最低抑菌浓度（MIC）,用改良三维试验检测52株柠檬酸杆菌ESBLs、AmpC、MBL的产酶情况,再用聚合酶链反应（PCR）法扩增β-内酰胺酶基因,并对扩增产物进行基因测序和同源性分析。结果三维试验检出31株柠檬酸杆菌产β-内酰胺酶,其中24株菌单纯产ESBLs,3株菌单纯高产AmpC,2株同时高产AmpC酶和ESBLs,未检出MBL。31株产β-内酰胺酶的柠檬酸杆菌对多种抗生素耐药。除均对亚胺培南和美罗培南均为100%敏感及对氨苄西林100%耐药外,β-内酰胺酶产生株对14种抗生素的耐药率显著高于非β-内酰胺酶产生株。PCR检出20株菌均携带blaTEM样基因,1株菌携带blaSHV样基因,8株菌携带blaCTX-M-1样基因,15株菌携带blaCTX-M-13样基因,5株菌携带blaCIT族基因。挑选5株TEM全编码基因测序均为广谱酶TEM-1基因;2株CTX-M-1组全编码基因测序为CTX-M-3亚型:3株CTX-M-13组全编码基因测序,2株为CTX-M-14亚型（GenBank注册号:EF416289）,1株为CTX-M-65亚型,均为国内外首次报道（GenBank注册号:EF394372）;4株CIT族全编码基因测序,1株为CMY-2亚型;1株与CMY-2编码基因序列的同源性为98%,13个碱基突变导致3个氨基酸的改变,是一种新的CMY亚型β-内酰胺酶,此序列被命名为CMY-35（GenBank注册号:EF394371）;2株（22和23号菌株）与CMY-2编码基因序列的同源性为99%,3个碱基突变导致2个氨基酸的改变,是一种新的CMY亚型β-内酰胺酶,此序列被命名为CMY-34（GenBank注册号:EF394370）。结论改良三维试验可用于检测同时高产AmpC酶和ESBLs的菌株。我院柠檬酸杆菌β-内酰胺酶检出率高,应重视β-内酰胺酶产生菌的检测。我院临床分离的柠檬酸杆菌对β-内酰胺类抗生素高度耐药,对氟喹诺酮类和氨基糖甙类药物敏感性也较差,对碳青霉烯类抗生素高度敏感。亚胺培南、美罗培南是治疗产β-内酰胺酶柠檬酸杆菌的最佳药物。β-内酰胺酶产生株对抗生素的耐药率明显高于非β-内酰胺酶产生株。柠檬酸杆菌所产β-内酰胺酶主要是ESBLs和AmpC酶。产ESBLs和AmpC酶是我院柠檬酸杆菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药的主要机制之一。产ESBLs柠檬酸杆菌的ESBLs基因型以CTX-M型为主,其次是TEM型。柠檬酸杆菌产β-内酰胺酶呈现多样性,同一菌株可携带多种β-内酰胺酶基因。第二部分柠檬酸杆菌qnr基因型和靶位酶改变的研究目的了解临床分离柠檬酸杆菌的耐药性及其耐氟喹诺酮类的机制,分析qnr基因和gyrA、gyrB、parC、parE基因突变引起柠檬酸杆菌对氟喹诺酮类敏感性降低的作用。方法收集2004年1月至2006年9月安徽医科大学第一附属医院临床分离的柠檬酸杆菌52株;聚合酶链反应（PCR）法扩增各组qnr基因以及gyrA、gyrB、parC和parE基因,对扩增产物进行基因测序和同源性比较,以确定qnr基因型,分析DNA旋转酶（gyrA、gyrB）和拓扑异构酶Ⅳ（parC、parE）的喹诺酮耐药决定区的基因突变情况;以qnr基因阳性菌株作为供体菌、E.coli J53AzR作为受体菌进行质粒接合试验,用叠氮化钠和氨苄西林两种药物筛选接合子;琼脂稀释法测定17种抗菌药物对52株柠檬酸杆菌以及E.coli J53和接合子的最低抑菌浓度（MIC）。结果52株柠檬酸杆菌中有22株细菌检出qnr基因,其中5株菌携带qnrA基因,11株菌携带qnrB2基因,1株菌携带qnrB4基因。挑选2株qnrA基因测序与阴沟肠杆菌质粒pEBQ-1上的qnrA1基因（GenBank登录号:DQ989302）的同源性为100%;3株qnrB2基因测序与弗劳地柠檬酸杆菌qnrB2基因（GenBank登录号:AB281054）的同源性均为97%,17个碱基突变导致2个氨基酸的改变,为新发现的一种qnrB基因型（GenBank注册号:EF526508）;1株qnrB4基因（GenBank注册号:EF543140）测序与大肠埃希菌qnrB4基因（GenBank登录号:DQ303921）的同源性为100%。细菌同时携带CMY-2型AmpC酶和qnrB2基因以及同时携带TEM、SHV、CTX-M13型ESBLs和qnrB4基因均为国内外首次报道。7株柠檬酸杆菌gyrA、gyrB、parC、parE基因测序结果显示,3株gyrA核苷酸序列与弗劳地柠檬酸杆菌标准菌株ATCC8090（GenBank登录号:AF052253）相应片段的同源性为99%,另外4株细菌gyrA核苷酸序列与大肠埃希菌K12（GenBank登录号:U00096）相应片段的同源性为98%,gyrB、parC、parE核苷酸序列与大肠埃希菌K12相应片段的同源性分别为98%、95%和88%。5株氟喹诺酮类耐药菌株主要存在gyrA基因Thr-83→Ile、Ser-83→Leu、Asp-87→Asn和parC基因Ser-80→Ile、Glu-84→Gly的突变。gyrB基因Leu-417→His和parC基因Lys-127→Arg为新发现的突变位点,与氟喹诺酮类耐药性无关。parE未发现氨基酸的改变。只有一株细菌qnrA基因接合试验成功,其他接合子获得了β-内酰胺酶基因。52株柠檬酸杆菌对左氧氟沙星、环丙沙星和加替沙星的耐药率分别为84.6%、86.5%和76.9%,接合子对15种抗菌药物的MIC均有不同程度的降低。结论我院qnr阳性柠檬酸杆菌的qnr基因型以qnrB型为主,其次是qnrA型。与非产β-内酰胺酶菌株相比,在产β-内酰胺酶菌株中存在增加氟喹诺酮类药物耐药率的因素。qnr基因的表达不仅可单独引起喹喏酮类的耐药,而且可明显增加其它耐药机制的作用。qnr基因的单独存在仅导致低水平的喹诺酮耐药,对氟喹诺酮类敏感。含qnr基因的菌株在喹诺酮药物的选择压力下容易发生染色体突变,导致高水平耐药,所以qnr基因的存在对靶位的改变、外排泵激活及外膜膜孔通道蛋白的缺失等染色体突变所致的耐药起补充作用。在G-杆菌中,DNA旋转酶是喹诺酮类药物作用的第一靶位,拓扑异构酶Ⅳ为第二靶位,gyrA基因单位点突变可能仅表现为对氟喹诺酮类药物的低水平耐药甚至不表现出耐药,当gyrA突变累积及parC突变时,则产生高水平耐药性,并且靶基因突变数目越多,突变涉及范围越大,喹诺酮类药物耐药程度就越高。此次研究柠檬酸杆菌临床分离株中qnr基因检出率较高,应引起高度重视。