真菌毒素(Mycotoxins)是指产毒的真菌污染农作物后,在适宜的温度、湿度环境下生长繁殖产生的一类有毒的次级代谢产物,对人和动物有极大的危害。其中,黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)为常见的一种真菌毒素,它主要由产毒的黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和集峰曲霉(Aspergillus nomius)等产生,多污染豆类、干果、花生和玉米等农产品,特别是在热带和亚热带地区。目前已经分离鉴定出来的黄曲霉毒素及其衍生物有20多种,其中黄曲霉毒素B1(AFB1的毒性最强,被世界卫生组织的国际癌症研究机构(IARC)划分为Ⅰ类致癌物质。为了避免AFB1的污染风险,几乎世界上所有的国家和地区都制定了 AFB1的强制限量标准。出于风险防范的目的,检测食品和饲料中AFB1的含量显得尤为重要。目前有许多方法可用于检测AFB1,主要包括薄层色谱法、液相色谱法和免疫学方法等。在这些方法中,免疫学方法由于其特异性强,灵敏度高,快速简便等优点被广泛地用来检测AFB1,但它需要高灵敏度和特异性的抗体。随着分子生物技术的不断发展,重组抗体特别是单链抗体(Single chain Fv antibody fragment,ScFv)由于其易于改造、制备过程较简单和表达量高等优点成为研究热点。然而,单链抗体与其亲本单克隆抗体相比,亲和力较低并且稳定性较差,从而导致在应用上具有局限性。研究抗原抗体间的反应,阐明单链抗体亲和力的影响机制,可为在基因水平上改造单链抗体,进一步提高其亲和力提供理论指导。本课题以实验室前期获得的单链抗体2C10氨基酸序列为基础,通过同源建模方法构建其三维结构模型,并将其与AFB1进行分子对接及对ScFv-2C10的CDR和FR区进行划分,预测ScFv-2C10与AFB1的结合位点,采用定点突变的方法对预测的氨基酸进行单点突变。将原始菌株和突变体均在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中诱导表达,并经纯化后,对突变前后单链抗体的亲和力进行分析。主要结果如下:1抗AFB1单链抗体的同源建模及分子对接以课题组获得的单链抗体(ScFv-2C10)VH和VL氨基酸序列为基础,采用同源建模的方法,通过目标序列同源建模模板的搜寻、目标序列与同源模板的多重序列比对、同源模型的构建和模型的评估、优化,得到一个比较合理的ScFv-2C10三维结构模型。为了探讨抗原抗体结合反应过程中起关键作用的氨基酸位点,将同源模型ScFv-2C10与AFB1进行分子对接,发现ScFv-2C10中氨基酸残基Arg-67、Asn-87和Lys-237与AFB!形成了氢键。随后将ScFv-2C10的CDR和FR区进行划分,重链及轻链均含有3个CDR区和4个FR区。基于以上研究,我们选择了 Arg-67、Asn-87、Lys-237以及重链和轻链CDR3区的极性氨基酸作为下一步研究的关键氨基酸。2抗AFB1单链抗体2C10突变体的构建针对预测的关键氨基酸残基,采用定点突变方法进行单点突变,将这些极性氨基酸突变为与其结构相似的非极性氨基酸。以课题组构建的pET-30a-pelB-ScFv-VH-linker-VL-2C10重组质粒为原材料,分别设计一对完全匹配的反向互补的、含突变的引物进行PCR扩增,获得含有突变位点的重组质粒。采用DpnⅠ限制性内切酶酶切PCR产物,将原始DNA质粒模板降解。将降解后的PCR产物转入E.coli trans5α感受态细胞,于LB/Kan固体平板过夜培养,经菌落PCR验证后送去测序。测序结果表明,成功获得14个突变体。3抗AFB1 ScFvs在E.coli BL21(DE3)的表达与性质分析将原始菌株及突变体均转入.coli BL21(DE3)感受态细胞中进行目的蛋白的诱导表达。目的蛋白经纯化后,采用考马斯亮蓝法对抗AFB1 ScFvs表达量进行定量分析,SDS-PAGE对抗AFB1 ScFvs进行表达分析,ELISA对抗AFB1 ScFvs的性质进行分析。结果表明ScFvs均在E.coli BL21(DE3)中成功表达,并以有活性的可溶性蛋白的表达形式存在。用ELISA对蛋白活性进行分析,突变体R67L的亲和常数较原始株提高约3倍,灵敏度较原始株提高约1倍。