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铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是革兰氏阴性非发酵菌,在自然界中分布广泛,是引起医院感染的主要致病菌之一,易获得性耐药,而碳青霉素类被认为是抗多重耐药的革兰阴性菌最有效的β-内酰胺类抗生素,现在也出现了对碳青霉素类耐药的多重耐药铜绿假单胞菌。已经成了公共卫生医疗的重要难题,目前是医院感染研究的热点。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)也称CD147,是一种高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白,在不同的炎症性疾病中可以检测到其表达的升高。MPAK信号通路是重要的细胞膜受体信号传导通路,参与了炎症反应和免疫反应,调控MAPK通路可以抑制细胞因子(如TNF-α、IL-6和IL-8)的分泌释放,从而有效地抑制病原菌感染。因此,本研究拟利用临床分离培养的产金属酶铜绿假单胞菌构建小鼠肺部感染模型,观察EMMPRIN能否通过MAPK通路提高宿主对产金属酶铜绿假单胞菌的抵抗力,为铜绿假单胞菌感染控制和临床抗感染治疗提供理论依据。第一部分铜绿假单胞菌感染耐药特征及分子流行病学目的:本研究旨在了解本地区临床分离的囊性纤维化患者的PA的感染情况及耐药特征,观察囊性纤维化患者分离的PA携带产MBL情况及分子流行病学特点。方法:收集2013年1月-2016年12月河南省中医院住院病人临床确诊为囊性纤维化患者的痰液或肺泡灌洗液样本进行细菌培养及药敏试验,同时收集患者的基本信息(年龄、性别、抗生素用药史等);使用法国梅里埃VITEK-2 Compact全自动微生物分析系统对572份标本进行菌种鉴定和药敏试验;筛选出对IPM耐药的PA菌株,采用琼脂稀释法测量其MIC值;采用亚胺培南-EDTA增效纸片法、梯度PCR法及基因测序法对分离的耐IPM的PA菌株进行MBL表型和基因型鉴定。结果:572份来自于肺囊性纤维化患者的标本中,有217名患者(37.9%)为PA感染阳性,其中159株(73.3%)对亚胺培南耐药、141株(64.9%)对美罗培南耐药、112株(51.6%)对头孢他啶、妥布霉素耐药、96株(44.2%)对哌拉西林-他唑巴坦、加替沙星、奈替米星耐药、78株(35.9%)对环丙沙星和庆大霉素耐药、62株(28.6%)头孢哌酮、头孢吡肟耐药、51株(23.5%)对阿米卡星耐药,32对(14.7%)头孢唑肟耐药;在分离的159份对亚胺培南耐药的样本中,其中MIC分布情况是512μg/ml为1株、256μg/ml为3株、128μg/ml为 9 株、64.0μg/ml 为 32 株、32.Oμg/ml 为 42 株、16.Oμg/ml 为 53 株、8.0Oμg/ml为 19 株、4.00μg/ml 为 0 株、2.0Oμg/ml 为 0 株、1.0Oμg/ml 为 0 株、0.5μg/ml 为 0株、0.25μg/ml为0株、0.125μg/ml为0株和0.06μg/m为0株;在159份分离的对亚胺培南耐药的样本中,90份(56.60%)为产MBL阳性,其中耐药基因最多是76份(84.4%)的基因型为blaVIM,69份(76.7%)的基因型为blaIMP。结论:本地区临床分离的囊性纤维化患者感染产MBL的PA对亚胺培南耐药较高,耐药基因以blaVIM和blaIMP为主,该地区PA的耐药基因分布情况未见文献报道,该研究发现的PA主要流行耐药基因与国内文献报道基本一致。第二部分EMMPRIN对宿主感染铜绿假单胞菌抵抗力的作用目的:探讨EMMPRIN在动物实验中提高宿主对产MBL的PA感染抵抗力中的作用及其机制。方法:①采用Real-time PCR法和ELISA法分别检测PA感染组和对照组在感染后0、1、3和5天小鼠肺部组织中EMMPRIN mRNA的表达水平和EMMPRIN的蛋白含量;②实验分为为PA感染组+siRNA-EMMPRIN 组、PA 感染组+siRNA-nc、对照组+siRNA-EMMPRIN组和对照组+siRNA-nc组;分离各组小鼠肺泡的巨噬细胞和肺组织,用Real-time PCR法检测各种细胞因子(INF-γ、TNF-α、IL-6、IL-12、IL-18、IL-4、IL-5 和 IL-10)mRNA水平,用ELISA法检测细胞各因子(INF-γ、IL-4、IL-6、TNF-α)蛋白的含量;③分别对PA感染后1天和5天的肺泡灌洗液进行菌落计数及肺组织MPO活性测定;④采用RT-PCR法检测对照组、重组EMMPRIN(rEMMPRIN)处理组、MAPK抑制剂U0126处理组和U0126+rEMMPRIN处理组肺泡巨噬细胞中 TNF-α、IL-6 和 INF-γ mRNA 水平的表达,用 ELISA 法检测 TNF-α、IL-6、INF-γ的蛋白含量;⑤采用Western blot法检测MAPK通路中各ERK和磷酸化ERK(p-ERK)的蛋白水平。结果:①PA感染后,EMMPRIN mRNA水平和蛋白水平均呈现升高趋势,高于相应天数的对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。②PA感染小鼠五天后,用肺泡巨噬细胞提取DNA,Real-time PCR结果显示 mRNA 水平 PA+siRNA-EMMPRIN 组与 PA+siRNA-nc 组相比 TNF-α、IL-6和INF-y mRNA水平和蛋白水平均降低,细菌数量明显升高,MPO活性升高,即中性粒细胞浸润增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。③Real-timePCR检测发现Th1细胞因子mRNA水平(INF-γ、IL-12和IL-18)的表达升高,Th2细胞因子mRNA水平(IL-4、IL-5和IL-10)的表达下降,检测细胞因子INF-γ和Th2细胞因子IL-4蛋白水平与mRNA表达相一致。④与对照组相比,加入rEMMPRIN后,TNF-α、IL-6和INF-γ mRNA水平的表达和蛋白水平的表达均升高;加入U0126后,TNF-αmRNA水平表达下降,而INF-y和IL-6mRNA水平表达稍有升高,但是蛋白水平表达下降,U0126+rEMMPRIN组与对照组相比IL-6和INF-y mRNA水平升高,Western blot结果显示在加入重组EMMPRIN后,Erk和磷酸化Erk(p-Erk)均表达升高,在加入U0126后,Erk和p-Erk的表达受到抑制。结论:研究结果表明,EMMPRIN能够影响中性粒细胞的趋化和浸润及Th1类和Th2类细胞因子的转录和表达,提高宿主抵抗铜绿假单胞菌感染的能力。其机制可能与MAPK的Erk通路调节相关,为临床上控制铜绿假单胞菌感染和抗感染治疗提供科学的实验依据。