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【研究目的】1、利用实时荧光定量PCR与Western Blot分析,金属硫蛋白1M(MT1M)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达特征。2、利用细胞增殖能力、细胞侵袭以及细胞迁移实验等研究,分析MT1M在NSCLC中的作用。研究MT1M参与肺癌形成的机制,为治疗药物研发提供新的研究方向。3、生物信息学分析筛选,MT1M表达所受转录调控因子调控的信号通路。研究MT1M构成的信号通路是否影响了NSCLC细胞增殖和细胞迁移,并探讨其可能的作用机制。【研究方法】通过基因芯片数据分析差异表达的基因,筛选出MT1M(GSE81292)在肺腺癌(LUAD)中呈现出低表达。我们收集了6例肺腺癌患者的癌组织与癌旁组织,分别运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western Blot技术,在转录水平和蛋白水平层面检测MT1M的表达量。进一步我们选取了NSCLC细胞株A549进行MT1M相关功能实验研究,在A549细胞中转染MT1M质粒,分别检测过表达MT1M后的细胞,对细胞增殖、细胞侵袭以及细胞迁移愈合能力的影响,以及高表达MT1M后对其他凋亡蛋白表达量的检测。我们通过基因相关性分析,MT1M基因的上游信号通路为p53,与MT1M基因启动子有结合位点。通过对A549分别转染MT1M质粒、p53抑制剂以及MT1M和p53抑制剂联合,验证细胞增殖能力、细胞侵袭以及细胞迁移愈合能力,同时对转染组细胞进行细胞相关迁移蛋白的检测。由于鼠双微体2(MDM2)对p53有调控作用,且在NSCLC中高表达,故排除其对p53的影响。首先,我们在A549细胞中敲低MDM2的表达,验证转染细胞株相关的细胞增殖能力、细胞侵袭和细胞迁移愈合能力;然后,对MDM2敲低组细胞联合MT1M过表达,验证细胞的增殖能力、细胞侵袭和细胞迁移愈合能力,以及对其他一些相关的细胞迁移蛋白表达量的检测;最后,进行免疫组化和免疫共沉淀实验验证MT1M、p53和MDM2蛋白之间是否存在调控作用。【研究结果】1、MT1M在NSCLC中的作用通过细胞转染MT1M质粒,培养48h后细胞增殖能力较对照组有所降低,继续培养72h后,实验组细胞的增殖能力则显著降低;实验组细胞的迁移愈合能力和细胞侵袭能力,均较对照组显著降低。Western Blot结果亦显示,在转染MT1M质粒的实验组细胞中,细胞迁移相关蛋白(MMP2、MMP9、MMP14)的表达量下降。2、p53对MT1M的调控p53可与MT1M启动子结合,加强MT1M双荧光素酶的荧光强度。抑制p53的功能,可拮抗过表达MT1M对细胞增殖、细胞迁移愈合能力和细胞侵袭能力的抑制作用。3、MDM2对p53-MT1M的调控在细胞中,敲低MDM2联合高表达MT1M后,对细胞增殖、细胞迁移愈合能力和细胞侵袭能力具有协同抑制作用。【结论】1、MT1M在NSCLC中低表达,且具有抑制肿瘤细胞活性的作用,可以考虑作为治疗的新靶点。2、MT1M基因的启动子序列存在和p53结合的位点,受到p53调控参与细胞增殖与迁移过程。3、MDM2-p53-MT1M构成的信号通路,与NSCLC细胞增殖和迁移能力密切相关。