猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）为新发现的圆环病毒,2016年被首次报道,能够引起猪皮炎与肾病综合征（PDNS）,繁殖障碍以及心脏与多系统炎症。PCV3基因组全长2000 nt,具有3个主要的开放阅读框（ORF）,ORF1编码复制酶蛋白,ORF2编码衣壳蛋白。PCV3与PCV2基因组的同源性仅为50%,与PCV1基因组的同源性仅为37%。本试验分别采用原核表达系统和真核表达系统（猪痘病毒载体）进行PCV3衣壳蛋白的表达,通过感染性克隆方法获得了PCV3拯救病毒,为今后建立PCV3免疫学检测方法及PCV3病毒的生物学特性研究打下基础。1.猪圆环病毒3型的PCR检测根据Gen Bank中猪圆环病毒3型（Accession number:KY354031.1）ORF2基因序列,设计猪圆环病毒3型PCR检测引物JC9F/R,建立了PCV3的PCR检测方法。利用该PCR检测方法对江西省2018年9月至2019年5月的181份猪组织病料进行了PCV3的PCR检测,结果检测出5份PCV3阳性病例,阳性率为2.76%。2.PCV3-ORF2的原核表达本试验以猪圆环病毒3型Accession number:KX458235.1作为参考序列,设计PCV3-ORF2引物。本试验PCV3阳性病料DNA作为模板,通过PCR扩增PCV3-ORF2片段,并分别克隆至p ET-32a和p GEX-4T-1构建重组表达载体p ET-32a-PCV3-ORF2和p GEX-4T-1-PCV3-ORF2,分别转化到BL21（DE3）p Lys S宿主菌。经诱导表达后,p ET-32a-PCV3-ORF2菌株表达的蛋白在SDS-PAGE中未见45 k Da目的条带;p GEX-4T-1-PCV3-ORF2菌株表达的蛋白在SDS-PAGE中也未见50 k Da目的条带,因此判定为PCV3-Cap蛋白未表达。3.PCV3-ORF2的真核表达本试验以PCV3阳性病料DNA作为模板,通过PCR扩增P28-PCV3-ORF2-His片段,构建了表达PCV3-Cap蛋白的猪痘病毒转移载体,并以In-fusion方法将目的片段连接至p SWE101载体。其中以猪痘病毒江西分离株作为亲本病毒,TK基因作为外源基因的插入位点,痘苗病毒（Vaccinai virus,VV）晚期启动子P28作为PCV3-ORF2的启动子,构建重组转移载体p SWE101-283CH。将质粒转染至亲本毒株SWPV-JX20G,获得表达PCV3-Cap蛋白的重组猪痘病毒r SWPV-P28-PCV3--ORF2-His,并进行重组蛋白的纯化。结果表明,重组猪痘病毒TK位点测序结果与预期一致,SDS-PAGE鉴定26 k Da处有目的蛋白表达,成功使用猪痘病毒载体表达PCV3-Cap蛋白,为进一步研究PCV3-Cap蛋白的免疫原性和建立PCV3抗体检测方法提供基础。4.PCV3感染性克隆的构建本试验以PCV3基因组参考序列（KX458235.1）为模板,以PCV3基因组的第21位碱基Bam H I酶切位点末端开始合成了PCV3全长DNA质粒。并以该质粒为模板,使用携带Bam H I酶切位点的PCV3全长引物P3001F/R,通过PCR获得PCV3全长DNA,再利用Bam H I酶切和T4连接酶连接的方式,构建了PCV3环状DNA。该T4连接产物经过DNA环化验证引物的PCR验证,证明T4连接产物中存在首尾连续的PCV3基因组DNA。将环状DNA使用脂质体转染PK-15细胞后,连续盲传19代,没有观察到细胞病变。取拯救病毒细胞培养物,提取DNA并进行PCV3核酸的PCR检测,每一代拯救病毒的检测结果均为PCV3阳性,可以判定为PCV3的病毒拯救成功,通过感染性克隆方法成功拯救了PCV3病毒。