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研究背景： Leigh综合征是线粒体病中的一种常见类型,新生儿出生发病率为1/40000,生命各个时期从婴幼儿至成人均可发病.目前报道已存在超过60种线粒体DNA和核基因突变都可以导致Leigh综合征的发生,本文研究的m.14487T>C突变是线粒体DNA相关的ND6上的位点突变.在我们的研究中m.14487T>C突变作为一个经典的线粒体病相关线粒体基因突变,并不清楚其在高异质率(接近100%)的情况下导致Leigh综合征发生的机制.我们通过对三个m.14487T>C突变的线粒体病家系进行的研究,首先获得三个病人及其母亲的血液血小板,后将血小板中的线粒体DNA与无线粒体DNA的143B Rho 0细胞融合,构建含有高低异质率m.14487T>C突变的细胞克隆.人们在研究中为了解线粒体DNA突变对疾病造成的影响,常通过此种含有突变线粒体DNA的融合细胞模型进行分析,在融合细胞模型的线粒体功能水平、细胞功能等一些机制方面探索;对未来诊断及治疗线粒体DNA突变所导致的线粒体病具有一定意义.在我们实验研究中,在线粒体功能、细胞功能、线粒体保护机制及应对氧化应激的能力多个方面上对高低异质率m.14487T>C突变融合细胞进行了分析. 目的： 1.为了研究m.14487T>C突变与Leigh综合征的关系,我们获得mtDNA全序测定筛选三个mtDNA中只有m.14487T>C突变的Leigh病患者的样本,并验证血液中突变的异质率. 2.探索高低异质率突变造成的差异,构建融合细胞,并挑选出三组高低异质率突变细胞. 3.为了研究此线粒体的突变造成线粒体的影响,对建立的m.14487T>C突变细胞克隆检测其线粒体功能差异性. 4.明确此突变是否造成了线粒体呼吸链电子传递障碍,是否有氧自由基损伤性物质产生. 5.探究是否存在保护机制,在分子生物学上进行抗氧化蛋白、转录因子及线粒体质量控制蛋白检测. 6.探讨在代谢应激条件下,高低异质率突变融合细胞应对氧化压力的细胞增殖能力的检测. 方法： 1.利用PCR-RFLP鉴定病人及其母亲血液中m.14487T>C突变异质率. 2.利用三个m.14487T>C突变病人及其母亲血液提取出血小板,将血小板中线粒体DNA与无线粒体DNA的143B rho 0细胞融合,构建此突变高低异质率的融合细胞.每个家系挑选高低异质率克隆各两个,共三组,十二株细胞,利用PCR-RFLP鉴定突变异质率. 3.对十二株细胞进行基因组DNA提取,利用两对引物对基因组DNA进行Long-range PCR,将PCR产物送去公司进行线粒体DNA二代测序检测. 4.使用非变性胶技术对已建立的融合细胞模型中的线粒体复合体单体和超级复合体的表达进行检测. 5.通过2D BN/SDS-PAGE验证高低异质率融合细胞中超级复合体的含量. 6.当细胞生长状况良好的情况下,检测高低异质率融合细胞的线粒体功能. 1)对线粒体复合体Ⅰ活性进行检测利用酶促反应原理并结合酶标仪. 2)对细胞氧耗能力评价使用Oxygraph-2k氧电极法. 3)对线粒体膜电位评价利用TMRM染料法. 4)对细胞ATP水平评价使用ATP检测试剂盒. 7.利用Mitosox和DCFH-DA对线粒体和细胞中的氧自由基ROS水平进行检测. 8.通过SDS-PAGE验证高低异质率融合细胞中抗氧化蛋白、线粒体质量控制蛋白、转录因子的水平. 9.先利用Trizol法提取细胞RNA,逆转录成cDNA,利用Real-time PCR的方法对线粒体轻、重链 mRNA水平进行分析. 10.通过SDS-PAGE检测高低异质率融合细胞线粒体数目,初步利用VDAC/Actin的比值来评价各细胞间的相对线粒体数目,之后利用更多线粒体蛋白验证. 11.通过CCK8检测试剂盒对细胞正常生长条件下及氧化应激条件下增殖能力进行分析. 12.利用SPSS16.0统计学软件分析结果. 结果： 1.通过PCR-RFLP技术,明确了三个病人及母亲血液中m.14487T>C突变异质率;第一个病人血液突变异质率约85%,其母亲约为0%;第二个病人近似100%,母亲0%;第三个病人近似100%,其母亲约0%. 2.利用二代测序技术,对十二个融合细胞的线粒体DNA全长Long-range PCR产物分析,得到第一个病人及母亲血液血小板构建的融合细胞突变异质率分别为0%、0%、99.7%、99.8%;第二个家系融合细胞分别是0%、0%、99.7%、99.7%;第三个家系融合细胞分别为0%、0%、99.8%、99.8%. 3.线粒体呼吸链的超级复合体和单体表达未受突变影响,利用二维电泳对超级复合体的含量分析,超级复合体的含量在高低异质率的细胞中无差别. 4.高低异质率细胞中复合体Ⅰ的活性没有显著差异. 5.应用Oxygraph-2k氧电极法检测高低异质率融合细胞中的内源性线粒体氧呼吸,L和H的基础氧呼吸没有明显差异;加入Oligomycin后抑制复合体V质子泵出后,L和H的呼吸功能无明显差异. 6.利用TMRM染料对线粒体膜电位进行检测,然后再在荧光显微镜下拍照,分析高低异质率融合细胞线粒体膜电位的荧光强度,高异质率融合细胞的膜电位水平相较于低异质率细胞没有出现膜电位下降. 7.通过ATP检测试剂盒对细胞中产生的ATP进行分析,发现高异质率突变的融合细胞产生的ATP和低异质率突变的融合细胞中ATP差异无统计学意义. 8.利用ROS检测试剂同时使用荧光显微镜或者酶标仪,发现此突变并没有造成细胞和线粒体中产生过多的自由基,在高低异质率突变细胞中无变化. 9.进一步利用SDS-PAGE研究一些保护性蛋白的表达,发现抗氧化蛋白SOD2在高异质率融合细胞中没明显高表达,线粒体质量控制蛋白GRP75、HSP60、AFG3L2、CLpP也无明显变化. 10.通过SDS-PAGE对常见的逆向信号通路转录因子表达水平检测,同时利用荧光定量对线粒体轻链和重链mRNA水平分析,并没有发现转录因子的变化. 11.利用SDS-PAGE对VDAC和Actin蛋白进行检测,初步通过VDAC/Actin的比值来反应线粒体数目,发现线粒体数目在高低异质率突变细胞中没有明显差异. 12.通过CCK8检测试剂盒对十二株细胞正常培养条件和氧化压力情况下细胞生长能力,我们发现高异质率突变的融合细胞生长较低异质率突变融合细胞速度稍微还快一点. 结论： 1.在高低异质率突变的融合细胞中,此突变并不影响线粒体超级复合体的表达和含量. 2.m.14487T>C突变未导致线粒体功能的明显差异,并未造成过多自由基损伤.此突变在融合细胞中极可能不影响其功能. 3.一些保护性的机制在高低异质率的融合细胞无明显差异,比如抗氧化蛋白SOD2、线粒体质量控制蛋白、转录因子水平无差异. 4.在代谢应激下,高异质率的融合细胞相较于低异质率融合细胞其细胞活力并无下降. 5.我们认为m.14487T>C突变对Leigh综合征的致病机制仍然存在不确定性,这是由于可能还存在线粒体DNA遗传背景的干扰,本研究中使用的线粒体DNA遗传背景均局限于中国人群;此突变的普遍致病机制还有待更加全面的深入研究.