目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是浅表性胃炎、消化性溃疡的致病因子,与胃癌、胃黏膜相关样淋巴组织瘤(MALT)密切相关,世界上约有一半以上的人感染Hp。目前使用抗生素根除Hp是治疗胃炎、消化道溃疡研究最透彻的方法。在使用根治Hp抗生素中,质子泵抑制药、克拉霉素、硝基咪唑类药物三联疗法最为流行。硝基咪唑类抗生素中,甲硝唑、替硝唑和奥硝唑分属于该类抗生素的第一、第二和第三代,近几年的研究显示,Hp对甲硝唑的耐药率越来越高。利福霉素类药物如利福平常用于抗结核病治疗,较少用于Hp感染的治疗,但近几年的研究显示,幽门螺杆菌对利福平的耐药率很低,可作为治疗幽门螺杆菌的新药。本研究是通过用琼脂稀释法和肉汤稀释法检测Hp对三种硝基咪唑类药物及利福平的耐药率并进行比较,旨在为实验室操作提供方法学比较的数据,并对Hp的治疗提供选药依据,指导临床医生合理使用抗生素。　　 方法:　　 1.菌株来源:2008年1月-2010年1月海南省临床微生物学检测与研究中心经API系统鉴定、保存的Hp临床分离株53株,质控菌株ATCC43504。本研究共做8次实验,每次实验检测8株菌,包含7株临床菌及1株质控菌(最后一次实验只检测4株临床菌和1株质控菌)。　　 2.琼脂稀释法检测Hp对甲硝唑、替硝唑、奥硝唑和利福平的耐药性:首先,配制药物原液。分别将甲硝唑、替硝唑、奥硝唑0.0256g溶于0.1ml二甲基亚砜中,后加入4.9ml无菌蒸馏水,配制成浓度为5120μg·ml-1的各药物原液。将0.0067g利福平溶于10ml甲醇中制成浓度为640μg·ml-1的甲醛溶液,后用无菌蒸馏水稀释至浓度为5μg·ml-1。第二,在平皿内倍比稀释药物。将各药物原液与Hp琼脂培养基按1:19比例混合,则此时的三种硝基咪唑药物浓度为256μg·ml-1,利福平的浓度为0.25μg·ml-1。用Hp琼脂培养基分别将各原液依次倍比稀释,共有十二个梯度,硝基咪唑药物的浓度梯度分别为256μg·ml-1、128μg·ml-1、64μg·ml-1、32μg·ml-1、16μg·ml-1、8μg·ml-1、4μg·ml-1、2μg·ml-1、1μg·ml-1、0.5μg·ml-1、0.25μg·ml-1、0.125μg·ml-1,利福平的浓度梯度分别为为0.25μg·ml-1,0.125μg·ml-1,0.0625μg·ml-1,0.032μg·ml-1,0.016μg·ml-1,0.008μg·ml-1,0.004μg·ml-1,0.002μg·ml-1,0.001μg·ml-1,0.0005μg·ml-1,0.00025μg·ml-1,0.000125μg·ml-1。同时倾倒不含药的琼脂培养基做无药生长对照。第三,标注平板。在每个平板上画出8个扇区(7个扇区为临床分离株所用,另外1个为质控菌株所用),标记药物、浓度及每个扇区的菌株号。第四,菌液制备:在菌株复苏传代至第三代后,选生长良好菌落增菌,制成菌悬液,使菌液浊度达到麦氏2.0。第五,接种培养。用微量移液器吸取2μl各菌悬液点样接种于各药物各浓度平板上相应的位置。37℃微需氧培养3天后观察结果,能抑制细菌生长的最小药物浓度为药物对细菌的最低抑菌浓度(MIC),记录四种药物对每株菌的最低抑菌浓度。　　 3.微量肉汤稀释法检测Hp对甲硝唑、替硝唑、奥硝唑和利福平的耐药性:首先,配制药物原液。分别将甲硝唑、替硝唑和奥硝唑溶于二甲基亚砜,溶解后用无菌蒸馏水配制成浓度为5120μg·ml-1的药物原液,然后用Hp培养肉汤10倍稀释,使浓度为512μg·ml-1,各取100μl分别加于微量反应板第一、二、三排的第一孔;用甲醇及无菌蒸馏水配制浓度为的5μg·ml-1利福平原液,然后用Hp培养肉汤10倍稀释,使浓度为0.5μg·ml-1,取100μl加于微量反应板第四排第一孔。第五排为无药对照,每孔加入肉汤50μl。第二,倍比稀释药物。分别从前四排的第二孔开始依次将药物用Hp培养肉汤倍比稀释至第十二孔。则每排的浓度梯度硝基咪唑为512μg·ml-1、256μg·ml-1、128μg·ml-1、64μg·ml-1、32μg·ml-1、16μg·ml-1、8μg·ml-1、4μg·ml-1、2μg·ml-1、1μg·ml-1、0.5μg·ml-1、0.25μg·ml-1,利福平的浓度为0.5μg·ml-1,0.25μg·ml-1,0.125μg·ml-1,0.0625μg·ml-1,0.032μg·ml-1,0.016μg·ml-1,0.008μg·ml-1,0.004μg·ml-1,0.002μg·ml-1,0.001μg·ml-1,0.0005μg·ml-1,0.00025μg·ml-1,0.00025μg·ml-1。第三,接种培养。先将琼脂稀释法时所配制的各菌悬液,用Hp培养肉汤稀释10倍,再用微量移液器吸菌液50μl,加入倍比稀释的各反应孔中,37℃微需氧培养3天后观察结果,记录四种药物对每株菌的最低抑菌浓度。　　 4.质量控制:本研究共做8次实验,每次实验检测8株菌,包含7株临床菌及1株质控菌(最后一次实验只检测4株临床菌和1株质控菌),质控菌株与临床株同时进行。只有菌株在无药培养基对照上生长良好且甲硝唑对质控菌株的最低抑菌浓度在64-256μg·ml-1时实验菌株所得数据才可用,否则视为实验失败,结果无效。　　 5.统计学处理:所有数据采用SAS9.0统计软件进行统计分析。琼脂稀释法和微量肉汤稀释法所得的MIC进行配对符号秩和检验并进行相关分析计算相关系数。计算出琼脂稀释法和肉汤稀释法所得的耐药率并进行卡方检验。琼脂稀释法检测硝基咪唑类药的耐药率比较用卡方检验。P＜0.05表示差别有统计意义。　　 结果:　　 1.琼脂稀释法检测53株Hp菌株中,甲硝唑的耐药率为66.04％,MIC范围为0.25-256μg·ml-1,50％最低抑菌浓度(能抑制一半细菌生长的最低药物浓度即MIC50)为16μg·ml-1,90％最低抑菌浓度(能抑制90％细菌生长的最低药物浓度即MIC90)为128μg·ml-1,替硝唑的耐药率为66.04％,MIC范围为0.125-256μg·ml-1,MIC50为16μg·ml-1,MIC90为128μg·ml-1,奥硝唑的耐药率为67.94％,MIC范围为0.125-256μg·ml-1,MIC50为16μg·ml-1,MIC90为128μg·ml-1,利福平的耐药率为0％,MIC范围0.00025-0.125μg·ml-1,MIC50为0.0078125μg·ml-1,MIC90为0.125μg·ml-1。　　 2.微量肉汤稀释法检测53株Hp菌株中,甲硝唑的耐药率为64.1％,MIC范围为0.25-256μg·ml-1,MIC50为0.25-256μg·ml-1,MIC90为128μg·ml-1,替硝唑的耐药率为66.04％,MIC范围为0.25-256μg·ml-1,MIC50为0.25.256μg·ml-1,MIC90为128μg·ml-1,奥硝唑的耐药率为69.81％,MIC范围为0.25-256μg·ml-1,MIC50为0.25-256μg·ml-1,MIC90为128μg·ml-1,利福平的耐药率为0％,MIC范围0.0005-0.125μg·ml-1,MIC50为0.00781250.016μg·ml-1,MIC90为0.125μg·ml-1。　　 3.琼脂稀释法和肉汤稀释法测得两种药物对Hp的MIC值分别进行配对秩和检验,均无统计意义,进行相关分析得相关系数r值分别为:甲硝唑组0.94,替硝唑组0.96,奥硝唑组0.91,利福平组0.89。与琼脂稀释法相比,肉汤稀释法的极严重错误率(very major error,VME)为:甲硝唑4％,替硝唑2％,奥硝唑2％,利福平0％。严重错误率(major error,ME)为:甲硝唑2％,替硝唑2％,奥硝唑2％,利福平0％。符合率(consistencerate,CA)为:甲硝唑94％,替硝唑96％,奥硝唑96％,利福平100％。两种方法耐药率进行卡方检验均无统计意义。　　 4.甲硝唑、替硝唑和奥硝唑三者的耐药率经统计分析无差异。　　 结论:　　 1.与琼脂稀释法相比,微量肉汤稀释法检测幽门螺杆菌分别对甲硝唑、替硝唑、奥硝唑及利福平的耐药率相当,可替代琼脂稀释法用于幽门螺杆菌耐药性的检测。　　 2.微量肉汤稀释法操作简便,成本更低,更适合临床检验工作。　　 3.幽门螺杆菌对三代硝基咪唑类药物的耐药率较高且无统计学差异,提示替硝唑和奥硝唑都不能代替甲硝唑来提高幽门螺杆菌的根除率,甲硝唑、替硝唑和奥硝唑均不适合用于一线抗幽门螺杆菌治疗。　　 4.利福平对幽门螺杆菌的敏感性较高,可作为根除幽门螺杆菌的二线药物。