【摘 要】
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3-岩藻糖基乳糖（3-Fucosyllactose,3-FL）是母乳寡糖中的重要成分之一,在所有岩藻糖基化的母乳寡糖中占比5%。,在预防婴幼儿传染病方面发挥着重要作用,作为益生元,3-FL拥有抑制有害微生物的生长的作用,由于其在婴幼儿配方奶粉中的应用价值,受到了广泛关注。3-FL的合成主要依赖全细胞发酵法。全细胞发酵法合成3-FL需要工程菌株具有高效的岩藻糖基化能力来高效的效率合成3-FL,已报导
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3-岩藻糖基乳糖（3-Fucosyllactose,3-FL）是母乳寡糖中的重要成分之一,在所有岩藻糖基化的母乳寡糖中占比5%。,在预防婴幼儿传染病方面发挥着重要作用,作为益生元,3-FL拥有抑制有害微生物的生长的作用,由于其在婴幼儿配方奶粉中的应用价值,受到了广泛关注。3-FL的合成主要依赖全细胞发酵法。全细胞发酵法合成3-FL需要工程菌株具有高效的岩藻糖基化能力来高效的效率合成3-FL,已报导的α1,3-岩藻糖基转移酶来源单一,初始酶活性较低,因此发掘新型高效岩藻糖基转移酶是全细胞发酵法生产3-FL的关键。本研究在BL21（DE3）宿主中构建了3-FL合成途径,并通过支路基因敲除、过表达代谢通路关键酶强化了3-FL合成途径得到3-FL合成重组菌株,以此菌株作为宿主进行筛选,发掘新型高效岩藻糖基转移酶,并对新酶进行组合模块化优化和发酵条件优化,经过分批补料发酵提升了3-FL产量。主要研究内容如下:（1）从头合成途径构建:将构建得重组质粒p CDF-man C-man B-gmd-wca G和p ETDuet-fut A（M32）转入BL21（DE3）中,过表达GDP-L-岩藻糖代谢通路的关键酶和岩藻糖基转移酶,并通过SDS-PAGE验证蛋白的表达,重组菌株3-FL的产量为0.24g/L。证明本研究成功构建3-FL从头合成代谢途径,且进一步验证了大肠杆菌不含有内源性α1,3-岩藻糖基转移酶。（2）宿主改造:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对3-FL代谢通路的竞争通路相关酶lac Z和Wca J进行敲除,获得的菌株转入p CDFman C-man B-gmd-wca G和p ET-fut A（M32）,进行摇瓶发酵实验,经过IPTG诱导72 h后,3-FL产量为0.43 g/L。验证了lac Z和Wca J的敲除对3-FL的合成具有促进作用。（3）新酶的筛选:通过BLAST推定出9种可能存在α1,3-岩藻糖基转移酶活性的酶,使用（2）中构建成功的3-FL生产菌株对其进行胞内发酵筛选,结果表明,其中的四个具有岩藻糖基转移酶活性,产量最高的fut M2酶的3-FL产量为1.98 g/L,本研究以此作为后续优化的出发酶。（4）模块化策略优化:通过组合模块化策略对重组菌株进行优化,将3-FL代谢通路的关键酶分为两个代谢模块,以质粒拷贝数的变化调节模块表达强度,经过摇瓶水平发酵验证,确定最佳的模块组合为p CDF-man C-man B-gmd-wca G和p ET-fut M2。（5）发酵条件优化:对获得重组菌株进行发酵条件优化,通过控制不同的诱导温度和诱导剂IPTG终浓度,以最优的发酵条件对重组菌株进行发酵验证,最终3-FL生产菌株在摇瓶水平获得了2.56 g/L的3-FL产量,提升了28.4%。（6）高密度分批补料发酵:为了进一步提高3-FL的产量,本研究以分批补料的形式进一步验证3-FL生产菌株的生产性能,在3 L发酵罐中,经过52 h的发酵,最终3-FL的产量达到了20.3 g/L。
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