论文部分内容阅读
以微生物为宿主重组表达生物活性蛋白或多肽一直是生物技术研究的热点。正电性抗菌肽（Cationic antimicrobial peptides,CAP）由于其独特的细胞毒机制而日益引起人们注意。蜂毒溶血肽（Melittin）作为一种典型的CAP具有多种生理活性。小鼠表皮生长因子（Mouse epidermal growth factor,mEGF）作为一种致细胞增殖因子在临床上也有广泛应用。本课题以大肠杆菌（E.coli）宿主重组表达Melittin和mEGF；以Melittin为毒性部分、mEGF为靶向部分，构建膜毒性免疫毒素；用定量竞争RT-PCR法测定mEGF体内表达丰度；检验所构建的各重组菌株的遗传稳定性；采用摇瓶分析对各重组菌株的发酵条件进行了初步优化。主要结果如下： 用Taq DNA聚合酶进行RT-PCR获得了中蜂（Apis cerana）Melittin和mEGF成熟区的cDNA克隆。与在37-42℃用Mulv或AMV进行反转录相比，在较高温度下（72℃）用Taq DNA聚合酶进行反转录有利于正确、完整的cDNA，因为在高温下mRNA的二级结构被充分打开。 用由pUC18载体衍生的pUCT载体进行克隆了中蜂（Apis cerana）Melittin成熟区cDNA。测序结果显示与意蜂（Apis mellifera）Melittin成熟区序列相比，中蜂（Apis cerana）Melittin成熟区序列在第33位存在差异（意蜂为A，中蜂为G），但两者蛋白质一级结构相同，说明Melittin作为蜜蜂一种重要的防御基因在进化上保守。 以E.coli为重组表达宿主，pET30a为表达载体，对中蜂（Apis cerana）Melittin进行了重组融合表达。活性检测显示Melittin融合蛋白的细胞毒活性很弱，仅在高浓度时方显示一定的细胞毒作用。但Melittin融合蛋白表达产物经CNBr切割释放出的天然形态的Melittin显示出良好的细胞毒活性，其粗提物对E. coli DH5 α的LD50值在1.6ug／mL（杀伤活性52.77±6.52％）与1.4ug／mL（杀伤活性47.14±5.16％）之间。这些结果表明表达产物呈正确的空间折叠，而其中由2个Lys和2个Arg组成的正电区对Melittin保持活性不可缺少。 用pGEMT载体克隆了mEGF成熟区cDNA，并采用定量竞争RT-PCR法测定了mEGF体内表达丰度。如以颌下腺中的相对表达丰度为1，则腮腺、肾脏、肺和肝脏中的相对表达丰度分别为：0.86±0.14、0.62±0.18、0.14±0.03和0.09±0.02。心脏和骨骼肌中未检测到表达。由于EGF在小鼠各器官中表达的普遍性，可以推测EGF的作用以旁分泌和自分泌作用为主，但它在颌下 博士学位论文“TnEGFAlelittin”嵌合基因构建及有关基因重组表达的研究 等器官中的高表达表明其也具有内分泌作用。这一结果为今后对针对EGFR的 抗肿瘤兔疫毒素进行安全性评价提供了基础资料。 以 E colt为重组表达宿主，pET30a为表达载体，对mEGF进行了重组融 合表达。表达产物mEGF融合蛋白具有较好的活性，其粗提物的活性相当于标 准mEGF的22．5儿预计今后在切除融合伴侣并经精细提纯后活性会进一步提 高。 将 mEGF和 Melittin的编码区通过一段寡核昔酸（linker）连接成嵌合 DNA“mEGFMel”，并以 E colt为重组表达宿主，pET30a为表达载体，对该嵌 合DNA进行了重组表达。表达产物“mEGF－Melittin”是一种膜毒性抗肿瘤免 疫毒素，体外活性检测表明其对表面过度表达EGFR的鳞状上皮癌A。。；细胞表现 出显著的杀伤力，粗提物的LDs。值在sl ug砌L与54ug加L之间。 在诱导表达各目的产物时诱导温度为 30 C。更低的温度会影响生物量， 而更高的温度虽有利于获得更高的生物量，但目的产物形成包涵体的比例会变 大。选择 30 C为诱导温度既避免了产物变性后所必需的复性环节，又能获得 相对较高的生物量。 破壁后提取 E COil中的目的产物会由于菌体蛋白的大量搀杂而使提纯步 骤繁琐，降低得率。本课题采用冻融法吓reezhg ＆ Thawing)对各表达产物 进行了初步提纯。结果显示该方法可在较大程度上避兔菌体蛋白的大量混杂， 产物纯度达到40％以上有利于目的产物后续进一步纯化。今后通过进一步试验 以优化冻融程序，有望使目的产物的纯度达到80％以上。 遗传稳定性检验表明，三株重组茵株 BLZI－pETMel、BL21－pETmEGF和 BLZIo 经传代50代后仍然保持原代细胞所含的外源插入的目的序 列，重组表达的目的产物的活性保持稳定，遗传稳定性良好。 通过摇瓶分析对三株重组菌株 BLZI－pETMe、BLZI－pETmEGF 和 BLZI丫 的发酵条件进行了初步优化。这三株菌株的最佳发酵条件基 本相同，即：装液量为 150mL： 接种量为 1．5饰 培养基初始 PH值为 7．0；使 用乳糖作为诱导物并确定最适诱导浓度为10000umol几，诱导效果优子IPTG； 最适诱导温度为3O℃；以甘油Og儿 为C源与以葡萄糖ug几)为C源相 比，对数期末菌体浓度提高