嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus,S.thermophilus)是一种兼具发酵剂应用价值和生物学研究价值的重要乳酸菌,广泛用于发酵乳的生产。CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因簇是一段成簇的短间距回文非编码序列,可通过整合新的间隔子序列实现对入侵外源DNA的记忆,而Cas(CRISPR-associated protein)蛋白则负责辅助CRISPR的转录产物cr RNA(CRISPR RNA),对外源DNA进行切割。二者协作组成了生物体的CRISPR-Cas系统,发挥抵御外源DNA侵染的作用。近年来,CRISPR编辑系统的构建成为研究的热点。本课题以嗜热链球菌为研究对象,对其CRISPR-Cas系统的分类与多样性做了较为系统和深入的研究,并进行了基于常规同源重组及CRISPR基因编辑技术的两种基因编辑载体的构建,旨在揭示嗜热链球菌CRISPR-Cas系统的多样性,同时为构建嗜热链球菌的CRISPR基因编辑系统奠定基础。本研究首先对分离自中国牧区传统发酵乳的22株嗜热链球菌的CRISPRs进行了鉴定,并对其重复序列的二级结构、间隔子的分布及其序列特征进行了分析。除3-Q、CS21和CS22菌株缺乏CRISPR3外,其余菌株均含有完整的四种CRISPR类型。对CRISPR重复序列(direct repeat,DR)二级结构的预测表明,所有四种DR序列都可以形成茎环结构,但茎、环的大小不同,进而导致其二级结构的稳定性不同。间隔子的同源性分析显示,大多数间隔子来源于外源DNA的部分序列,包括多种噬菌体和质粒。值得注意的是,本研究发现了大量新型间隔子,推测这些菌株经历的独特噬菌体环境,尤其是3-Q菌株。此外,对22株嗜热链球菌cas基因的系统发育分析表明,不同菌株中相同cas基因的同源性非常高。然而,不同CRISPRs中同一种cas基因的同源性相对较低,为研究菌株间的亲缘关系提供参考。其次,本研究以嗜热链球菌的三个双组分系统(two component system,TCSs)(hpk1/rr1、hpk2/rr2及hpk5/rr5)为目的基因,设计并构建了可用于基因敲除的p RV300重组载体,拟为菌株突变体的构建奠定基础。本实验分别将目的基因的上下游片段连接于p RV300空载体上,最终获得了同时连有上下游片段的重组质粒p R1D(12)、p H2D(25)、p R2D(10)及p R5D(16);此外,构建完成了仅连有目的基因上游片段的p H1U(10)和p H5U(10)两个载体。最后,基于CRISPR-Cas9基因编辑技术,本研究设计并构建了可用于嗜热链球菌基因编辑的p Cas Sth载体。该载体含有复制原点、启动子、Cas9序列、抗性基因以及用于质粒消除的rep A基因等,可在连接间隔子、靶基因上下游同源臂后用于特定基因的敲除。根据靶基因设计并合成间隔子序列后,将其连接于p Cas Sth,本实验获得了重组质粒p H1(1)-spacer、p R1(9)-spacer、p H2(12)-spacer、p R2(4)-spacer、p H5(17)-spacer、p R5(1)-spacer。接下来,将靶基因的上下游片段连接于含间隔子的各p Cas Sth重组载体上,获得了完整的敲除载体p Cas Sth-H2。以上结果为后续嗜热链球菌的CRISPR基因编辑系统的构建奠定了基础。