研究目的和意义宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一,严重危害女性健康和生命安全。化疗是宫颈癌重要的辅助治疗手段,其效果对于降低患者死亡率,延长生存期和改善生活质量十分关键。铂类是宫颈癌治疗的一线化疗药物,尤其是顺铂在宫颈癌治疗中显示出良好的效果。然而由于肿瘤异质性、个体差异等因素,化疗效果具有不确定性,肿瘤耐药是导致宫颈癌化疗失败的最主要原因。目前关于宫颈癌耐药的详细机制尚未完全察明,探索耐药产生的原因、寻找解决耐药性的方法是当前肿瘤研究的热点和难点。Wnt/β-catenin是最经典的信号通路之一,与肿瘤的发生发展密切相关,多项研究发现在卵巢癌、肾癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等人类肿瘤中均存在Wnt通路过度激活,认为Wnt/β-catenin途径可能是众多肿瘤发生的共同通路。化疗耐药是宫颈癌患者治疗失败和预后不良的最主要原因,查明宫颈癌的化疗耐药机制,加深对宫颈癌耐药过程中复杂信号通路网络调控的认识,能为宫颈癌耐药研究提供新的视角。本研究欲探讨Wnt/β-catenin信号通路在宫颈癌顺铂耐药中所发挥的作用及其作用机制。研究结果对于寻找宫颈癌耐药相关的潜在分子靶点,寻找解决耐药性的方法具有重要价值,未来可能给宫颈癌的临床治疗带来重大突破和进展。研究方法第一部分:以原发性宫颈癌患者组织和复发性顺铂耐药宫颈癌组织为研究对象,通过RNA-seq测序分析两组中的基因表达差异,通过免疫组化、qPCR以及Western blot等分子生物学手段做进一步的验证,通过TCGA数据库分析差异表达基因与病人预后的关系。第二部分:采用大剂量冲击诱导法,用终浓度为10 μ g/ml的顺铂溶液诱导人宫颈癌SiHa、HeLa、C33A和CaSki细胞系,建立相应的宫颈癌顺铂耐药细胞模型,比较宫颈癌细胞和耐药细胞在形态、耐药性及其他生物学特性方面的差异。第三部分:用β-catenin真核表达载体和Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939单独或联合处理宫颈癌顺铂耐药细胞,实时荧光定量PCR和Western Blot检测不同处理后宫颈癌顺铂耐药细胞中β-catenin及Wnt/β-catenin通路上Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测顺铂诱导下各组细胞的凋亡率,MTT法检测各组细胞的增殖情况。第四部分:用皮下注射法诱导建立宫颈癌顺铂SiHa耐药细胞裸鼠皮下移植瘤模型,将裸鼠随机分为对照组、顺铂组、β-catenin+顺铂组和XAV939+顺铂组,给予相应干预后,观察裸鼠一般情况和移植瘤生长情况,测量瘤体积,绘制移植瘤生长曲线,21天后处死动物,取肿瘤组织,Tunel检测移植瘤凋亡,免疫组化检测核蛋白K i-67表达,Western Blot检测Wnt/β-catenin通路上Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled 蛋白的表达。研究结果第一部分:RNA-seq分析发现在3例复发性顺铂耐药患者宫颈癌组织中存在Wnt/β-catenin信号通路的异常激活。应用免疫组化、qPCR和Western blot等实验方法进一步验证发现,与正常宫颈组织相比,β-catenin在原发性宫颈癌组织中表达增高,而在复发性顺铂耐药的宫颈癌组织中β-catenin的表达较上述2组异常增高(P<0.05),Western blot结果还表明Wnt/β-catenin信号通路下游靶蛋白Survivin在复发性顺铂耐药的宫颈癌组织中的表达显著上调(P<0.05)。通过分析TCGA数据库分析宫颈癌组织中β-catenin和Survivin表达与病人生存曲线的关系,结果发现宫颈癌组织中β-catenin和Survivin的表达与患者生存时间呈负相关,β-catenin和Survivin的表达越高,病人生存时间越短。第二部分:1.经诱导建立的宫颈癌SiHa/DDP、HeLa/DDP、C33A/DDP和CaSki/DDP细胞系的RI分别为12.34,7.92,7.13和17.65,表现出对顺铂中到重度耐药。2.SiHa/DDP、HeLa/DDP、C33A/DDP 和 CaSki/DDP 细胞和各自亲本细胞在顺铂诱导下的凋亡率分别为(3.3±0.64)%vs.(36.9±2.56)%,(8.56±1.27)%s.(47.55±3.78)%,(22.71±4.19)%vs.(47.44±6.97)%和(12.38±3.56)%vs.(58.44±5.63)%,耐药细胞凋亡率均显著低于其相应的亲本细胞(P<0.01)。3.SiHa、HeLa、C33A和CaSki细胞系中β-catenin mRNA和蛋白水平均较正常宫颈鳞状上皮细胞(Ect1/E6E7)显著升高(P<0.05),SiHa、HeLa、C33A和CaSki顺铂耐药细胞系中β-catenin mRNA和蛋白水平均较其亲本细胞进一步升高(P<0.05)。第三部分:1.在SiHa、HeLa、C33A和CaSki顺铂耐药细胞中过表达β-catenin,其下游信号因子 Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled mRNA和蛋白水平均显著升高(P均<0.05),Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939处理后,4 种耐药细胞系中 Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled 的 mRNA和蛋白水平均呈现下降趋势。2.细胞增殖和凋亡结果显示,随着时间的延长,4种宫颈癌顺铂耐药细胞中β-catenin组细胞增殖能力最强,凋亡不明显,而β-catenin+XAV939组,增殖减弱,凋亡明显,XAV939明显抑制了细胞增殖,并诱导细胞凋亡。第四部分:1.动物实验结果显示,成功构建了宫颈癌顺铂耐药SiHa细胞裸鼠皮下移植瘤模型,与对照组相比,顺铂组和XAV939+顺铂组裸鼠移植瘤体积较对照组和β-catenin+顺铂组明显下降,XAV939+顺铂组移植瘤体积较顺铂组明显下降;对照组和β-catenin+顺铂组无明显差异,移植瘤体积整体变化从大到小依次为对照组/β-catenin+顺铂组>顺铂组>XAV939+顺铂组。2.顺铂组、β-catenin+顺铂组、XAV939+顺铂组和对照组的凋亡指数分别为(16.26±1.34)%,(7.96±0.53)%、(27.33±1.78)%和(6.54±0.32)%。XAV939+顺铂组凋亡指数高于顺铂组(P<0.05),且两者均高于对照组(P<0.05);β-catenin+顺铂组凋亡指数与对照组无显著差异(P>0.05)。3.免疫组化结果显示顺铂组移植瘤中Ki-67蛋白表达的平均光密度为(0.038+0.0120),较对照组降低(P<0.05),XAV939+顺铂组Ki-67蛋白表达的平均光密度为(0.024±0.008),较对照组和顺铂组降低(P均<0.05)。4.对照组和 β-catenin+顺铂组中 Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled的蛋白表达水平无显著差异(P>0.05),β-catenin+顺铂组β-catenin、Survivin、c-myc和MMP-2的蛋白水平较顺铂组显著升高(P<0.05);XAV939+顺铂组β-catenin、Survivin、c-myc蛋白水平较顺铂组则显著降低(P<0.05)。研究结论1.在复发性顺铂耐药的宫颈癌组织中存在Wnt/β-catenin信号通路的异常激活,而该通路在正常宫颈组织和原发性宫颈癌组织中的表达则比较弱,提示Wnt/β-catenin与宫颈癌顺铂耐药有密切关系。临床大数据研究显示Wnt/β-catenin激活与生存期存在负相关。2.Wnt/β-catenin信号通路在宫颈癌顺铂耐药细胞中异常活化,且其通路上关键因子Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled转录水平和蛋白表达上调。3.Wnt/β-catenin信号通路过度激活能提高宫颈癌顺铂耐药性,增强细胞的增殖活力,降低细胞凋亡,促进肿瘤的生长;抑制Wnt/β-catenin信号通路后能降低宫颈癌细胞对顺铂的耐药性,促进细胞凋亡,抑制裸鼠移植瘤的生长。4.动物实验表明Wnt/β-catenin信号通路活化降低宫颈癌耐药细胞对顺铂的敏感性;抑制Wnt/β-catenin信号通路能提高宫颈癌对顺铂的敏感性,促进顺铂的抗癌效果,Wnt/β-catenin抑制剂和顺铂两者联用能促进顺铂的抗癌效果。