【研究目的】钩虫感染目前仍然在中低等收入的热带和亚热带国家流行,对社会经济和公众健康具有广泛影响。在世界上许多经济贫困和发展滞后的偏远农村地区,钩虫病仍是一个亟待解决的公共卫生问题。目前镜检法对于钩虫种的检测鉴定耗时、费力且缺乏准确性,因此,开发准确快速的检测和鉴定感染人体钩虫种的方法具有重要的实用价值。本课题提取人粪便样本中的钩虫卵基因组DNA,利用半巢式PCR技术对感染人体的钩虫种进行检测分类,通过与镜检法比较,评价其检测效果。【研究方法】(1)粪便样本的采集:现场采集西双版纳傣族自治州景洪市和勐海县多所小学五年级学生的粪便样本,以及普洱市江城县多所小学三至五年级学生的粪便样本,采用改良加藤法对每份粪便进行“一粪三检”,经镜检确定寄生虫虫卵类型同时进行分类计数,筛选出含有钩虫卵的样本共66份(其中部分样本同时伴有蛔虫、鞭虫、绦虫的感染),随机挑选20份不含钩虫卵(部分含蛔虫、鞭虫卵)的粪便样本作为阴性对照。将样本置于盛有95%乙醇的5ml冻存管中,做好标记,于4℃冰箱保存并带回实验室,准备进行下一步检测。(2)PCR方法的应用:采用半巢式PCR方法扩增所采集粪便样本中钩虫卵核糖体DNA的内转录间隔区2(the second internal transcribed spacer,ITS2)和28S RNA序列来对钩虫种进行检测鉴定。经2%琼脂糖凝胶电泳判断结果后,选择部分阳性PCR产物测序,测序结果经BLAST比对进一步确定基因类型。同时对DNA的提取方法进行改进,对PCR非特异性扩增的消除方法进行探索,采用倍比稀释法检测半巢式PCR的灵敏度。【结果】镜检钩虫卵阳性的66份粪便样本中,经DNA提取方法的改进后,PCR检测的敏感性由62.12%(41/66)提升至96.97%(64/66)。本研究发现在云南省南部地区美洲钩虫98.43%(63/64)是感染人类的优势钩虫种,其次是锡兰钩虫1.56%(1/64),未检测到十二指肠钩虫的感染。本研究未检测到其他虫种,特异性为100%,与镜检的一致率为97.67%,说明两种检测方法一致性较好。灵敏度检测结果表明该检测方法的检测下限为稀释256倍的DNA原液,即每克粪便含约4个钩虫卵。【结论】1.本研究表明:通过方法改进,此半巢式PCR方法具有准确、快速、灵敏、特异性高的优点,可直接用于检测及鉴定人粪中的钩虫卵,是一种有实用价值的流行病学调查工具。2.本研究证实经过研磨的方法改进,促进了钩虫卵卵壳和卵膜的破裂,提高了虫卵DNA提取的成功率。3.降低外侧引物的浓度可以消除PCR的非特异性扩增。4.本研究再次检测到锡兰钩虫的感染,提示该钩虫病存在人兽之间相互感染的风险。