论文部分内容阅读
果胶酶作为添加剂广泛应用于食品行业的果汁澄清工艺中,发现和挖掘适用于工业应用的优质果胶酶,能够为工业应用提供更多的选择。本文从嗜热Talaromyces leycettanus JCM 12802菌株中克隆得到三个多聚半乳糖醛酸酶基因Tepg28a、Tepg28b、Tepg28c,其中一个为外切型两个为内切型,并全部在毕赤酵母GS115中实现高效异源表达。对纯化后的三个重组蛋白进行酶学性质的研究,其最适pH和最适温度均一致,分别为3.5和70 oC,三者在酸性至中性的环境中都具有很好的pH稳定性,在60 oC的高温环境下保持高度稳定性,同时在70oC中保温10 min后仍能剩余40%的剩余酶活,值得注意的是TePG28c的比活高达51786 U/mg,要高于目前报道所有多聚半乳糖醛酸酶。基于Tepg28a和Tepg28b为两种不同类型的多聚半乳糖醛酸酶,他们对聚糖切割方式的不同,在其添加比TePG28a:TePG28b=2:3(U:U)的时候对橘皮果胶表现出很好的协同作用,是单独使用一种酶的作用效果的240%,并且两个酶能够协同作用于天然葡萄汁的澄清,使葡萄汁的透光度从20%提升到80%以上。总的来看,这三个多聚半乳糖醛酸酶具有优异的酶学性质,并且表现出巨大的工业应用的潜力。在这个基础上,以TePG28b为研究对象,在对其蛋白结构和同源比对分析后,选取底物结合区域的非结合位点,采用点突变的方法,将底物结合区中带负电荷的天冬氨酸(Asp)突变成带正电荷的赖氨酸(Lys),从而在底物结合区中引入正电荷的,使得增强多聚半乳糖醛酸酶的催化口袋与天然条件下带负电荷的果胶类底物的结合力,从而达到提高催化效率的目的。从结果上来看,该策略对于TePG28b具有明显的效果,突变体TePG28bD113K相较于原酶来说,底物亲和力略微的下降,但比活和催化效率分别提高了0.8倍和0.2倍。该改造策略也在另一个从Bispora sp.MEY-1中克隆得到的内切型多聚半乳糖醛酸酶BsPG28a中得到了验证,突变体BsPG28aD107K相较于原酶BsPG28a来说,底物亲和力不变,比活和催化效率分别提高了2.8和2.5倍。两个突变体相较于原酶在催化效率和比活上都有所提高,且BsPG28aD107K提高的比TePG28bD113K更显著。总体来说,本文在嗜热真菌Talaromyces leycettanus JCM 12802克隆得到了三个酶学性质优异的优质多聚半乳糖醛酸酶,通过酶学性质及其协同作用和应用评估的研究后表现出巨大的应用潜力,为工业用酶提供了一定的选择和借鉴作用。通过在多聚半乳糖醛酸酶底物结合区的非结合位点突变引入正电荷氨基酸,成功的提高了TePG28b和BsPG28a的比活和催化效率,为多聚半乳糖醛酸酶催化效率的分子改造提供了一种有效的策略,具有重要的科学意义和应用价值。