论文部分内容阅读
研究背景及目的:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)在世界上是一种发病率和死亡率很高的常见疾病[1],通常与高血脂,高血压,糖尿病和吸烟等有着密切的联系,是一个多因素的复杂过程[2-5],这些均与内皮功能障碍有关。因此,内皮功能障碍也被公认为是AS发生发展的始动环[6,7]。其中导致AS发展的多重的机制包含慢性炎症损伤[8]。目前,寻找一种药物,其能够有效保护血管内皮细胞损伤和降低心血管发病率是非常重要的。二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG),是从传统中药何首乌的干燥块根中所提取的主要有效生物活性成分,研究表明TSG有抗氧化,抗炎,抗血小板凝集和提高记忆力与学习能力等作用[9,10]。近年来,TSG的抗AS作用被人们广泛关注,但其作用机制仍不十分明确。本研究旨在探讨TSG对LPC诱导血管内皮细胞损伤的作用和机制,加速TSG作为一种预防心血管疾病包括AS的药物的发展。本研究首先研读相关文献并对常用LPC损伤模型的建立条件进行筛选并优化;其次建立细胞模型用以探讨TSG对LPC损伤模型的作用及机制。研究方法:本实验借助溶血性磷脂酰胆碱(Lysophosphatidylcholine,LPC)诱导人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)损伤模型来评价TSG的血管保护作用。采用MTT法、CCK-8法、流式细胞术法、透射电镜法、Elisa法、RT-PCR法和蛋白免疫印迹(Western Blotting)等实验方法,观察:①TSG对LPC损伤HUVECs的抗氧化应激的作用和机制;②TSG对LPC损伤HUVECs的抗炎症损伤的作用和机制。研究结果:1、LPC的最佳造模浓度LPC浓度为10μg/m L时为最佳造模浓度,与细胞对照组比,差异具有统计学意义(P<0.01)。2、TSG对LPC诱导HUVECs凋亡的作用和机制(1)TSG呈浓度依赖性增强细胞活力,与LPC(10μg/m L)模型组比较,TSG(1.0、10.0μmol/L)组差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)细胞凋亡率随着TSG浓度的升高而降低,与LPC(10μg/m L)模型组比较,TSG(1.0、10.0μmol/L)组差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)透射电镜显示,随着TSG浓度的增加,细胞内空泡减少,线粒体较完整。(4)SOD、GSH-Px的活力随着TSG浓度的增加而增强,而MDA、ROS的含量随着TSG的增加而减少,与LPC(10μg/m L)模型组比较,TSG(1.0、10.0μmol/L)组差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)Bax、caspase-3、Cyt C、PARP-1 m RNA的表达随着TSG浓度的增加而降低,Bcl-2的表达随着TSG的升高而升高,与LPC(10μg/m L)模型组比较,TSG(1.0、10.0μmol/L)组差异具有统计学意义(P<0.05)。(6)线粒体膜电位与TSG成浓度依赖性升高,与LPC(10μg/m L)模型组比较,TSG(1.0、10.0μmol/L)组差异具有统计学意义(P<0.05)。(7)Bax、caspase-3、Cyt C、PARP-1蛋白的表达随着TSG浓度的增加而降低,Bcl-2蛋白的表达随着TSG的升高而升高,与LPC(10μg/m L)模型组比较,TSG(1.0、10.0μmol/L)组差异具有统计学意义(P<0.05)。3、TSG对LPC损伤HUVECs的抗炎症损伤的作用和机制(1)随着LPC浓度的增加显著降低细胞活力,增加Notch1、Hes1的蛋白表达,10、20μg/m L组差异均具有统计学意义(P<0.05)。(2)DAPT+LPC组与LPC(10μg/m L)模型组比较,细胞活力明显升高,细胞凋亡率明显降低,Notch1、Hes1、MCP-1蛋白表达明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05),并且DAPT+LPC组细胞内部空泡显著减少,线粒体较完整。(3)Notch si RNA+LPC组与LPC(10μg/m L)模型组比较,细胞活力明显升高,细胞凋亡率明显降低,Notch1、Hes1、MCP-1蛋白表达明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05),并且Notch si RNA+LPC组细胞内部空泡显著减少,线粒体较完整。(4)细胞粘附能力随着TSG浓度的升高而增强,与LPC(10μg/m L)模型组比较,TSG(1.0、10.0μmol/L)组差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)迁移能力随着TSG浓度的升高而增强,与LPC(10μg/m L)模型组比较,TSG(1.0、10.0μmol/L)组差异具有统计学意义(P<0.05)。(6)IL-6、CRP随着TSG的浓度的增加而减少,与LPC(10μg/m L)模型组比较,TSG(1.0、10.0μmol/L)组差异具有统计学意义(P<0.05)。(7)Notch1、Hes1、MCP-1 m RNA的表达随着TSG浓度的增加而降低,与LPC(10μg/m L)模型组比较,TSG(1.0、10.0μmol/L)组差异具有统计学意义(P<0.05)。(8)Notch1、Hes1、MCP-1蛋白的表达随着TSG浓度的增加而降低,与LPC(10μg/m L)模型组比较,TSG(1.0、10.0μmol/L)组差异具有统计学意义(P<0.05)。研究结论:综上所述,(1)确立了LPC损伤模型的最佳浓度。(2)二苯乙烯苷抑制LPC诱导HUVECs凋亡作用与阻断线粒体凋亡信号转导通路相关。(3)二苯乙烯苷对LPC诱导HUVECs炎症损伤的作用可能与调节Notch信号转导通路相关。