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目的胰腺癌(pancreatic carcinoma,PC)起病隐匿,发展迅速,是一种极其具有侵袭性的恶性肿瘤,它的5年总生存率小于10%。胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是PC最常见的组织学类型,所占比例大于85%。PDAC发病机制尚不明确,且缺乏特异性的肿瘤标志物,为疾病的诊断和治疗带来了巨大困难。因此,探索PDAC的发生发展机制,寻求新的肿瘤标志物及靶标对PDAC患者有着重要的意义。自噬是一种细胞质量控制的重要机制,在维持机体组织的稳态、抵抗外来病原体和肿瘤的发生发展等方面发挥着重要作用。自噬对细胞具有双重作用:其一,自噬可以清除机体受损的蛋白及细胞器,为细胞提供营养物质;其二,自噬过度活化,细胞内物质持续降解,将会导致细胞死亡。当前,自噬对肿瘤产生的效应及其作用机制已经成为一个研究新热点。非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA)是指不参与编码蛋白质的RNA。研究证实,nc RNA可以通过调节细胞中蛋白的表达、调控信号通路及细胞周期等方式影响肿瘤的发生发展。微小RNA(mi RNA)属于nc RNA的一员,是一种长度约为22个核苷酸的保守非编码RNA。mi RNA可以通过沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)调控靶基因的表达,参与转录后调控、mi RNA的剪切及翻译。mi R-663a过去曾被命名为mi R-663,在多种恶性肿瘤中均有被报导,mi R-663a对急性淋巴细胞白血病、胶质母细胞瘤、肠癌、甲状腺癌等是一种潜在的肿瘤抑制因子,而它在鼻咽癌、乳腺癌中起致癌基因的作用。近年来,越来越多的mi RNA被发现参与自噬调节的过程,由于自噬和肿瘤关系紧密,科研人员开始逐渐关注mi RNA在自噬以何种角色对肿瘤产生影响,mi RNA能否通过影响自噬抑制肿瘤。本课题组前期芯片测序发现:在使用氯喹抑制自噬后,mi R-663a表达水平显著下调。我们在芯片结果中选取抑制自噬后显著上调的基因,与网络生物信息学数据库预测的mi R-663a靶基因取交集,选择IL2RB作为实验靶标。课题组提出假说:抑制mi R-663a能够通过靶向IL2RB抑制自噬,阻碍PDAC细胞的增殖和迁移。希望本研究能够丰富PDAC的相关机制研究,为寻找更好的诊断、治疗方法提供理论依据和实验基础。实验分两部分进行:第一部分mi R-663a/IL2RB在PDAC中的表达及抑制mi R-663a对癌细胞增殖、迁移的影响材料与方法1.材料:1.1免疫组化实验纳入2012-2018年期间广西医科大学第一附属医院病理科诊断的PDAC石蜡蜡块标本,包括癌组织78例,癌旁组织36例;实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-q PCR)实验纳入2013-2018年期的PDAC石蜡蜡块标本,其中癌组织68例,正常组织36例。1.2细胞系:PDAC细胞系PANC-1、SW1990、MIA Pa Ca;胰腺正常细胞系Hped6-C7。2.方法2.1生物信息学分析:检索GEO、Array Express、TCGA、Oncomine数据库中的芯片数据,提取mi R-663a和IL2RB在PDAC组织中的表达数据。计算PDAC和对照组的表达平均数和标准差,进行meta分析并作森林图,漏斗图用于发表偏倚的分析。2.2 RT-q PCR检测细胞株及PDAC石蜡蜡块中mi R-663a和IL2RB的表达情况,并结合临床参数进行分析。2.3免疫组化染色检测IL2RB在PDAC与癌旁胰腺组织的阳性表达情况。2.4双荧光素酶实验验证mi R-663a和IL2RB两者靶向关系。2.5通过CCK-8实验、划痕实验、transwell小室迁移实验检测抑制mi R-663a对PDAC细胞的增殖、侵袭的影响。结果1.mi R-663a在PDAC的表达及临床病理意义GEO数据库检索并提取6个PDAC的组织芯片,相较于癌旁组织,4个芯片中mi R-663a在癌组织表达上调,2个芯片中mi R-663a表达下调。采用RT-q PCR检测mi R-663a在细胞株的表达,结果表明:相较于Hped6-C7细胞株,mi R-663a在PANC-1、SW1990细胞株中高表达(P=0.0379;P=0.0251),在MIA-PACA低表达(P=0.833)。采用RT-q PCR检测mi R-663a在石蜡蜡块的表达,结果表明:mi R-663a在PDAC中的表达高于癌旁组织(P=0.2895)。mi R-663a的表达水平与患者性别(P=0.038)与神经浸润(P=0.028)有关,与患者年龄、肿瘤生长部位、肿瘤最大径、烟酒史、TMN分期、淋巴结转移、血管浸润无明显相关联。2.IL2RB在PDAC的表达及临床病理意义使用GEO、Array Express、TCGA、Oncomine芯片及测序数据整合进行meta分析,PDAC中IL2RB表达低于癌组织,结果无统计学意义(P=0.732)。采用RT-q PCR检测IL2RB在细胞株的表达,结果表明:相较于Hped6-C7细胞株,IL2RB在PANC-1、SW1990细胞株低表达(P=<0.0001;P=0.0447),在MIA-PACA高表达(P=0.0400)。RT-q PCR检测石蜡样本中IL2RB的表达,结果表明:相较于癌旁组织,IL2RB在PDAC组织中低表达(P=0.0788)。IL2RB的表达水平与肿瘤生长部位(P=0.027)有关,与患者年龄、性别、肿瘤最大径、烟酒史、TMN分期、淋巴结转移、神经血管浸润无明显关联。免疫组化染色结果表明:IL2RB在PDAC的表达低于癌旁组织(χ2=27.440,P<0.05)。3.mi R-663a/IL2RB的靶向关系预测及验证经Target Scans Human 7.2检测,mi R-663a和靶基因IL2RB存在结合位点,并经过双荧光素酶实验验证。4.抑制mi R-663a对PDAC细胞增殖能力的影响cck8增殖实验检测抑制mi R-663a后,实验组和空白组的OD值,结果表明:抑制mi R-663a略微抑制PANC-1细胞的增殖能力,但结果无统计学意义(P>0.05)。5.抑制mi R-663a对PDAC细胞迁移能力的影响划痕实验结果表明:抑制mi R-663a阻碍了PANC-1细胞的平面迁移能力(P<0.05)。Transwell迁移实验结果表明:抑制mi R-663a阻碍了PANC-1细胞的迁移能力(P<0.05)。第二部分PDAC细胞中mi R-663a与自噬的相互调控作用材料与方法1.材料1.1细胞系:PDAC细胞系PANC-1、SW1990、MIA Pa Ca;胰腺正常细胞系Hped6-C7。1.2 Westtern Blot抗体:IL2RB;自噬相关蛋白P62、ATG5、LC3B。2.方法2.1采用RT-q PCR检测自噬相关基因ATG5、LC3B、P62在细胞株及石蜡蜡块的表达。2.2在PANC-1细胞加入100μmol/L浓度的氯喹,抑制自噬,24小时后采用RT-q PCR检测mi R-663a和IL2RB的表达值。2.3抑制mi R-663a后,使用Western Blot检测自噬相关蛋白ATG5、LC3B、P62在细胞中的表达,通过自噬蛋白表达的变化,判断自噬水平。结果1.自噬相关基因在PDAC细胞株的表达RT-q PCR结果表明:相较于Hped6-C7细胞株,ATG5在PANC-1高表达(P=0.0330),在SW1990、MIA-PACA低表达(P<0.0001;P=0.0020);LC3B在PANC-1、MIA-PACA高表达(P=0.0005;P<0.0001),在SW1990低表达(P=0.0050);P62在PANC-1、SW1990、MIA-PACA中均为低表达(P=0.0002;P<0.0001;P<0.0001)。RT-q PCR检测PDAC与癌旁组织中自噬相关基因的表达,ATG5、LC3B在癌组织中高表达,P62在癌组织中低表达(P>0.05)。2.抑制自噬对mi R-663a表达的影响RT-q PCR结果表明,自噬抑制后,PDAC细胞中mi R-663a表达下调(P<0.05)。3.抑制自噬对IL2RB表达的影响RT-q PCR结果表明:自噬抑制后,PDAC细胞中IL2RB表达上调(P<0.05)。Western Blot检测结果表明:自噬抑制后,PDAC细胞中IL2RB的蛋白表达表达出现上调,但结果无统计学意义(P>0.05)。4.抑制mi R-663a对自噬的的影响Western Blot检测自噬相关蛋白ATG5、LC3B、P62的表达,结果表明:抑制mi R-663a后,ATG蛋白表达减弱,LC3BⅠ和P62蛋白表达增强,但无统计学意义(P>0.05)。全文结论1.抑制自噬后,PDAC中mi R-663a表达水平降低,IL2RB表达水平升高,但是抑制mi R-663a后自噬蛋白无明显改变,在PDAC中mi R-663a不是通过调控自噬影响肿瘤。2.抑制mi R-663a表达能够抑制PDAC细胞的迁移能力。IL2RB与mi R-663a存在直接调控的靶向关系,mi R-663a与IL2RB结合后抑制其表达,所以mi R-663a可能是通过调控IL2RB影响PDAC的发生发展。