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阿尔茨海默病（AD）和相关的神经系统变性疾病在老年人中的发病率越来越高，甚至被认为是二十一世纪的瘟疫。神经营养因子作为神经保护剂用于治疗中枢神经系统变性疾病已得到了广泛关注，但因其均为大分子蛋白质而难以通过血脑屏障的特点限制了临床应用。近年来小分子肽被认为可能成为它的替代品。活性依赖性神经保护蛋白（activity-dependent neuroprotective protein，ADNP）是一种由血管内皮肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）作用神经胶质细胞后产生的高活性神经营养因子，对多种原因引起的神经元损伤具有神经保护作用。有研究证实ADNP上的一段8肽NAP比ADNP具有更强的神经保护作用以及更低的有效浓度 （10-15Mol）。虽然NAP的分子量小于1000，认为它可以通过血脑屏障（BBB），在AD等中枢神经系统疾病的治疗中拥有广阔的前景。然而NAP的半衰期短，体外人工合成的成本较高等因素限制了其用于慢性神经系统退行性疾病的治疗。为了更好的将NAP用于AD的基因治疗，本研究克隆了神经保护短肽NAP cDNA，将其与神经营养素4（neurotrophin 4，NT4）的信号肽和前导序列相连，构建了NT4与NAP融合基因的原核表达载体pBV220/NT4-NAP，进而成功诱导分泌表达了NAP蛋白。为进一步将NAP用于中枢神经系统变性疾病的基因治疗奠定了基础。实验方法 一、NAP基因cDNA的制备：采用非对称互补引物/模板法，根据GenBank 提供的NAP基因序列，设计两端含有酶切位点的NAP cDNA的正、负向引物/模板链， 正向引物/模板：5’GCAGCCGGCGTGGCAACGCACCAGTTTC-3’； <WP=49>负向引物/模板：5’CGGGATCCCTCGAGTCATTGAGGAATGGAAACTGG-3’。制备两端含有酶切位点的NAP的cDNA。二、载体的构建策略和步骤：用限制性内切酶Nae I和BamH I联合酶切除去质粒pGEM-T Easy/NT4中NT4的成熟区，将NAP cDNA连接到NT4的信号肽和前导序列的3’端，组成融合基因NT4-NAP，筛选得到含有NT4-NAP基因的克隆。用限制性内切酶EcoR I和BamH I联合酶切，得到融合基因NT4-NAP，并将其亚克隆到原核表达质粒pBV220中。三、酶切鉴定和DNA测序：限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。融合基因重组于pGEM-T Easy质粒中，筛选得到含有NT4-NAP基因的克隆。采用Sanger 单链末端终止法测出全部的核苷酸序列，比较该序列与GenBank所报道的结果。四、 生物活性鉴定 经鉴定的重组质粒pBV220/NT4-NAP转染大肠杆菌DH5α, 42℃热诱导表达融合基因，分泌表达NAP蛋白。分离培养8d鸡胚背根神经节(SC-DRG)，培养12h后加入回收的表达蛋白0.1 mL或单纯培养液，继续培养24h，相差倒置显微镜下，观察神经节生长情况。用χ2检验比较两组结果。实验结果 经DNA测序，限制性内切酶酶切等方法证实已成功地将NAP重组到NT4信号肽和前导序列的3’端。重组原核表达质粒pBV220/ NT4-NAP构建正确，表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达NAP蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出，对照组未见神经突起长出（P<0.01）。研究结果提示 成功克隆的NT4-NAP融合基因，重组于原核表达载体中，重组质粒pBV220/NT4-NAP可分泌表达NAP蛋白，而且分泌表达的NAP<WP=50>蛋白有良好的生物活性。本研究为进一步开展NAP基因治疗AD病等中枢神经系统退行性疾病创造了有利条件。 综上所述，神经营养因子一直被认为在治疗中枢神经系统退行性疾病中具有发展潜力，但因其均为大分子蛋白，无法通过血脑屏障，需脑室内注射给药，给临床应用带来了极大困难。NAP是一种由VIP介导神经胶质细胞分泌的神经保护短肽，其对神经系统的保护作用已被大量研究证实。这些研究提示NAP在治疗AD等中枢神经系统退行性疾病中有广阔的发展前景。为了更好的应用NAP治疗AD，本研究采用先进的分子生物学技术，应用非对称互补引物/模板法，根据GenBank提供基因序列克隆了NAP cDNA；由于NAP是活性依赖性神经保护蛋白（ADNP）中一段8肽，缺少分泌表达元件，这给应用基因工程技术在体内或体外分泌表达NAP带来了困难。因此本研究将NAP cDNA的5’端连接到NT4的信号肽和引导肽序列的3’端，构成融合基因NT4-NAP；本研究在原核细胞系统经热诱导表达了融合基因，其结果显示表达的蛋白具有良好的生物学活性，能够促进神经节组织周缘神经突起的生长。这不仅是对NAP神经营养作用的再次肯定；同时融合基因克隆的成功，以及在原核细胞系统中的正确表达和加工，为我们进一步将NT4-NAP重组入真核细胞系统，在体内外瞬时表达NAP；或将其重组入腺相关病毒（AAV），在体内外长期表达NAP，从而构建一种神经保护肽的体内分泌表达策略奠定了基础。这也为其他神经营养短肽的应用提供了新的线索，为AD基因治疗的下一步研究提供理论基础。