研究背景甲状腺功能减退症是因为甲状腺素分泌不足而发生的内分泌疾病,是儿科最常见的内分泌疾病之一。目前已知甲状腺炎症损伤是获得性甲减的最常见病因,但甲状腺炎的具体病理学机制并不清楚。长链非编码RNA(Long noncoding RNAs,IncRNAs)和微小RNA(microRNAs，miRNAs)具有复杂多样的生物学功能,能够调控许多疾病的发生。研究目的本研究通过脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)诱导甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-ori-3.1发生炎症损伤,以此来探究IncRNA-H19在Nthy-ori-3.1细胞炎症损伤中的作用和机制,为进一步阐明甲状腺炎症损伤的病理学机理和对甲减进行有效的治疗与干预提供新的依据。研究方法第二章LPS诱导Nthy-ori-3.1细胞增殖抑制、凋亡和炎症因子过表达损伤将Nthy-ori-3.1细胞转接到添加了 10%的胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的正常的RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640)培养基中,在含有95%的空气和5%的二氧化碳的细胞培养箱中进行37℃常规培养。以此条件下生长的细胞作“对照组”。向细胞培养液中添加10 ng/ml的LPS,在与“对照组”相同的培养条件下处理细胞12个小时,以此作为“LPS处理组”。利用细胞计数盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)实验方法分别检测“对照组”和“LPS处理组”中Nthy-ori-3.1细胞的活力。通过异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate，FITC)偶联膜联蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(Propidium iodide,PI)双染色法(Annexin V-FITC/PI)和流式细胞检测技术分别检测了“对照组”和“LPS处理组”Nthy-ori-3.1细胞的凋亡率。以β-actin作内参,利用蛋白质免疫印迹法分别检测了两个组份细胞中的凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Pro/Cleaved-caspase3 以及炎性细胞因子白细胞介素 1β(Interleukin-1,IL-1β)、IL-6、单核细胞趋化因子 1(Monocyte chemoattractant proteinl,MCP-1)的蛋白表达情况,并利用Image LabTM图像处理软件分别对Bax、Bcl-2和Cleaved-caspase 3的蛋白质条带进行了量化分析。以GADPH作内参,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)实验检测了“对照组”和“LPS处理组”细胞中的IL-lβ、IL-6、MCP-1在RNA水平上的相对表达量。通过酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定了各处理组细胞中炎性细胞因子的实际含量。使用Graphpad统计分析软件对实验数据进行统计学分析并计算尸值。两组之间使用t-test或单因素方差分析法(One-way analysis of variance，ANOVA)进行差异性比较。所有实验至少重复三次。第三章过表达IncRNA-H19缓解LPS诱导的Nthy-ori-3.1细胞增殖抑制、凋亡和炎症因子过表达损伤本实验克隆合成了lncRNA-H19片段,并利用pEX-2质粒构建了1ncRNA-H19的过表达载体pEX-H19。利用lipofectamine 3000试剂将pEX-H19及其阴性对照(pEX-2质粒)分别转染到了 Nthy-ori-3.1细胞中,构建了“LPS + pEX-H19”处理组和“LPS + pEX-2”处理组。本实验首先利用qRT-PCR确定了 LPS对1ncRNA-H19的表达产生的影响,确定了细胞的转染效率,检测了不同处理组Nthy-ori-3.1细胞中的IL-lβ、IL-6和MCP-1在RNA水平上的表达情况。其次,再次通过CCK-8计数法分别测定了“对照组”、“LPS处理组”、“LPS + pEX-2”处理组和“LPS + pEX-H19”处理组Nthy-ori-3.1细胞的活力。通过Annexin V-FITC/PI双染色法搭配流式细胞仪技术测定了各个处理组份细胞的凋亡率。以β-actin作内参,利用蛋白质免疫印迹检测了不同处理组Nthy-ori-3.1细胞中的促调亡蛋白Bax和Pro/Cleaved-caspase 3、抗凋亡蛋白Bcl-2和炎性细胞因子IL-1β、IL-6和MCP-1的蛋白表达情况,并通过Image LabTM软件对Bax、Bcl-2和Cleaved-caspase 3的蛋白条带进行量化分析。最后利用ELISA试验检测了“对照组”、“LPS处理组”、“LPS + pEX-2”处理组和“LPS + pEX-H19”处理组Nthy-ori-3.1细胞中IL-1β、IL-6和MCP-1的具体含量。所有实验至少重复三次,使用 Graphpad统计分析软件对实验数据进行统计学分析并计算尸值,两个组份之间的差异性比较用t-test或ANOVA进行。第四章过表达IncRNA-H19通过下调表达miR-21减轻LPS诱导的细胞损伤并抑制JNK和NF-KB信号通路的活性本次实验通过公司合成了 miR-21 mlimic及其阴性对照(Negative control,NC)mimic,用以改变细胞中miR-21的表达量。通过lipofectamine 3000试剂盒分别将本次实验合成的miR-21 mimic与之前合成的IncRNA-H19的过表达载体pEX-H19共转染到了Nthy-ori-3.1细胞中,同时将NC mimic与pEX-H19也共转染到了 Nthy-ori-3.1细胞中(作为阴性对照)。然后对转染细胞进行LPS诱导,构建了“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”处理组和“LPS + pEX-H19 +NC mimic”处理组。与之前的实验相同,通过CCK-8计数法分别检测“对照组”、“LPS处理组”、“LPS + pEX-2 + NC mimic”处理组、“LPS + pEX-H19 +NC mimic”处理组和“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”处理组中Nthy-ori-3.1细胞的活力。通过Annexin V-FITC/PI双染色法搭配流式细胞仪技术分别检测了各个处理组当中的细胞的凋亡率。用蛋白质免疫印迹法检测不同处理组细胞中促凋亡蛋白Bax和Pro/Cleaved-caspase 3、抗凋亡蛋白Bcl-2和炎性细胞因子IL-lβ、IL-6和MCP-1的蛋白表达情况。同时对细胞中的核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路相关蛋白和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信号通路相关蛋白,包括磷酸化的NF-κB抑制蛋白(Inhibitor of NF-κB，IκB)(Phosphorylated NF-KB,p-IκB)、总体IκB(Total IκB,t-IκB)、磷酸化的p65蛋白(Phosphorylated p65，p-p65)、总体p65蛋白(Total p65，t-p65)、磷酸化的JNK蛋白(Phosphorylated JNK，p-JNK)和总体JNK蛋白(Total JNK,t-JNK的表达情况进行了测定。β-actin做内参。利用Image LabTM软件对Bax、Bcl-2和Cleaved-caspase 3 的蛋白条带以及p-κB与t-IκB 的比值(p/t-IKB)、p-p65与t-p65的比值(p/t-p65)和p-JNK与t-JNK的比值(p/t-JNK)进行了量化分析。通过qRT-PCR方法测定了“对照组”、“LPS处理组”、“LPS + pEX-2”处理组和“LPS + pEX-H19”处理组Nthy-ori-3.1细胞中miR-21在RNA水平上的表达量;细胞转染实验之后,利用qRT-PCR实验检测了miR-21的相对含量,确定了转染效率;并检测了各处理组细胞中的IL-1β、IL-6和MCP-1在RNA水平上的表达量。在对实验材料做了相应的处理之后,利用ELISA检测了“对照组”、“LPS处理组”、“LPS + pEX-2 + NC mimic”处理组、“LPS + pEX-H19 +NC mimic”处理组和“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”处理组细胞Nthy-ori-3.1细胞中的IL-1β、IL-6和MCP-1的具体含量。所有实验至少重复三次,使用Graphpad统计分析软件对实验数据进行统计学分析并计算尸值,两个组份之间的差异性比较用t-test或ANOVA进行。研究结果第二章LPS诱导Nthy-ori-3.1细胞增殖抑制、凋亡和炎症因子过表达损伤细胞活力和细胞凋亡实验检测结果发现,与“对照组”相比,LPS处理使Nthy-ori-3.1细胞的活力显著降低(尸<0.01);使细胞凋亡率(尸<0.001)和促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase 3的相对表达量(二者P<0.001)显著增加,使抗凋亡蛋白Bcl-2的相对表达量(P<0.001)显著降低。炎症因子表达结果表明,相比于“对照组”LPS处理显著促进了 IL-lβ、IL-6和MCP-1在mRNA水平上的表达(P<0.001,P<0.001和尸<0.01);使细胞中的IL-lβ、IL-6和MCP-1的实际含量明显增加(所有尸<0.001)。说明,LPS处理诱导Nthy-ori-3.1细胞发生了炎症损伤。第三章过表达IncRNA-H19缓解LPS诱导的Nthy-ori-3.1细胞增殖抑制、凋亡和炎症因子过表达损伤本次实验结果表明,相比于“对照组”细胞,“LPS处理组”细胞中的IncRNA-H19的相对表达量显著降低(尸<0.01)。与“对照组”相比,“LPS +pEX-2”处理组细胞中IncRNA-H19的表达情况未发生明显的改变;但相比于“LPS+ pEX-2”处理组,“LPS + pEX-H19”处理组细胞中IncRNA-H19的表达量显增加(尸<0.001)。细胞活力和细胞凋亡检测结果表明,相比于“对照组”,“LPS处理组”细胞的活力显著降低(尸<0.01);与“LPS处理组”相比,“LPS + pEX-2”处理组细胞的活力没有发生明显的改变;相比于“LPS + pEX-2”处理组,“LPS +pEX-H19”处理组细胞的活力显著上升(尸<0.05)。与“对照组”相比,“LPS处理组”细胞的凋亡率(P<0.001)和Bax以及Cleaved-caspase 3蛋白的相对表达量显著增高(二者P<0.001),Bcl-2蛋白的相对表达量显著降低(P<0.001);与“LPS处理组”相比,“LPS + pEX-2”处理组细胞的凋亡率和各物质的相对表达量没有发生明显的改变;与“LPS + pEX-2”处理组相比,“LPS + pEX-H19”处理组细胞的凋亡率(P<0.05)以及细胞中的Bax和Cleaved-caspase 3蛋白的相对表达量显著降低(二者P<0.05),Bcl-2蛋白的相对表达量则显著增加(尸<0.01)。检测炎症因子表达情况的实验表明,在RNA水平上,相比于“对照组”，“LPS处理组”细胞中IL-lβ、IL-6和MCP-1的相对表达量均显著增加(尸<0.001，尸<0.01和尸<0.01);“LPS + pEX-2”处理组和“LPS处理组”的情况基本相同;相比于“LPS + pEX-2”处理组,“LPS + pEX-H19”处理组细胞中IL-lβ、IL-6和MCP-1的相对表达量均明显降低(所有P<0.05)。在蛋白质水平上各个炎症因子的表达情况与在RNA水平上的变化趋势相同。ELISA检测发现,相比于“对照组”,LPS处理使细胞中的IL-1β、IL-6和MCP-1的含量显著增加(尸<0.001，尸<0.01和尸<0.001);与“LPS处理组”相比,“LPS + pEX-2”处理组细胞中各个炎症因子的含量没有发生明显的改变;相比于“LPS + pEX-2”处理组，“LPS + pEX-H19”处理组细胞中IL-lβ、IL-6和MCP-1的含量均显著降低(所有P<0.05)。这些结果表明,过表达IncRNA-H19能够缓解LPS对Nthy-ori-3.1细胞诱导的炎症损伤。第四章过表达IncRNA-H19通过下调表达miR-21减轻LPS诱导的细胞损伤并抑制JNK和NF-κB信号通路的活性本次实验结果表明,与“对照组”细胞相比,“LPS处理组”细胞中的miR-21发生过表达,miR-21的表达量显著增加(尸<0.01);“LPS处理组”与“LPS +pEX-2”处理组之间不存在显著性差异;与“LPS + pEX-2”处理组相比,“LPS+ pEX-H19”处理组细胞中,miR-21的表达量显著降低(尸<0.01)。细胞转染实验表明,与“对照组”相比,转染NC mimic没有对miR-21的表达量产生明显的影响;相比于转染NC mimic,转染miR-21 mimic使细胞中miR-21的相对表达量显著增加(P<0.01)。细胞活力和凋亡试验结果显示,与“对照组”相比,LPS处理使细胞活力显著降低(尸<0.01);相比于“LPS处理组”,“LPS + pEX-2 + NC mimic”处理组细胞的活力没有发生明显的变化;相比于“LPS + pEX-2 + NC mimic”处理组,“LPS + pEX-H19 + NC mimic”处理组细胞的活力显著增强(P<0.05);与此相比,“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”处理组的细胞活力明显降低(尸<0.05)。相比“对照组”,LPS处理使细胞的凋亡率(尸<0.001)以及促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase 3的相对表达量显著增加(二者P<0.001),抗凋亡蛋白Bcl-2的相对表达量显著降低(P<0.001);与“LPS处理组”与“LPS+ pEX-2 + NC mimic”处理组细胞之间在凋亡率和各凋亡蛋白的表达量方面不存在明显的差别;相比于“LPS + pEX-2 + NC mimic”处理组,“LPS +pEX-H19 + NC mimic”处理组细胞的凋亡率(尸<0.05)以及Bax和Cleaved-caspase 3蛋白的相对表达量显著降低(二者P<0.05),Bcl-2蛋白的表达水平显著增加(尸<0.05);与“LPS + pEX-H19 + NC mimic”处理组相比,“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”处理组细胞的凋亡率(P<0.05)以及Bax和Cleaved-caspase 3蛋白的相对表达水平明显升高(二者尸<0.05),Bcl-2蛋白的表达水平显著降低(尸<0.05)。细胞炎症因子检测实验结果表明,与“对照组”相比,“LPS处理组”细胞中的IL-1β、IL-6和MCP-1的相对表达量显著升高(P<0.001，P<0.001和P<0.01);与“LPS处理组”相比,“LPS + pEX-2 + NC mimic”处理组细胞中的炎症因子的相对表达量没有发生具有统计学意义的变化;相比于“LPS +pEX-2 + NC mimic”处理组细胞,“LPS + pEX-Hl9 + NC mimic”处理组细胞中炎性细胞因子的相对表达量显著降低(所有尸<0.05);相比于“LPS +pEX-H19 + NC mimic”处理组,“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”处理组细胞中的IL-1β、IL-6和MCP-1的相对表达量显著升高(P<0.01，尸<0.01和尸<0.05)。ELISA的检测结果发现,与“对照组”相比,“LPS处理组”细胞中IL-1β、IL-6和MCP-1的含量显著升高(所有P<0.001);与“LPS处理组”与“LPS +pEX-2 + NC mimic”处理组之间不存在明显差别;相比于“LPS + pEX-2 +NC mimic”处理组,“LPS + pEX-H19 + NC mimic”处理组细胞中三种炎症因子的实际含量均显著降低(所有尸<0.05);与“LPS + pEX-H19 + NC mimic”处理组相比,“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”处理组细胞中各个炎症因子的实际含量显著增加(所有尸<0.05)。各个炎症细胞因子在蛋白质水平上的表达情况与在RNA水平上一致。信号通路实验结果表明,与“对照组”相比,“LPS处理组”细胞中的p-IκB、p-p65和p-JNK蛋白的表达量以及p/t-IκB、p/t-p65和p/t-JNK明显增加(所有尸<0.001);与“LPS处理组”相比,“LPS + pEX-2 + NC mimic”处理组细胞中各蛋白质的表达水平和p/t-IKB、p/t-p65和p-JNK没有发生明显的改变;与“LPS+ pEX-2 + NC mimic”处理组相比,“LPS + pEX-H19 + NC mimic”处理组细胞中p-IκB、p-p65和p-JNK蛋白的表达水平显著降低,p/t-IKB、p/t-p65和p/t-JNK明显减小(所有尸<0.05);与“LPS + pEX-H19 + NC mimic”处理组相比,“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”处理组细胞中 p-IκB、p-p65 和p-JNK蛋白的表达水平明显升高,p/t-1lκB、p/t-p65和p/t-JNK显著增大(所有尸<0.05)。此外,所有处理组的细胞中t-IKB、t-p65和t-JNK蛋白的表达量均未发生明显改变。这些结果说明,过表达1ncRNA-H19通过下调表达miR-21减轻了 LPS诱导的细胞炎症损伤。结论:过表达1ncRNA-H19通过下调表达miR-21减轻了LPS诱导的Nthy-ori-3.1细胞增殖抑制、凋亡和炎症因子过表达等炎症损伤。意义:本实验通过探索1ncRNA-H19在LPS诱导的炎症损伤中的作用和机制,进一步阐明了甲状腺炎症损伤的病理学机制,为甲减的干预和治疗提供了新的视点。