AD-GFP-NM23-H1转染ACC-M细胞CD44v6、VEGF表达及其体内毒性实验研究

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目的:利用腺病毒介导的含nm23-H1的基因药物Ad-GFP-nm23-Hl体外转染体外培养的人腺样囊性癌肺高转移细胞株ACC-M,观察其对癌相关基因VEGF、CD44V6的调控作用,同时初步进行动物毒性实验,对其安全性作出评价,从而为后期nm23-H1基因和腺病毒载体用于更高级灵长类动物研究以及肿瘤的基因治疗研究提供一定的理论和方法。方法:1.细胞转染设转染滴度108PFU/ml、109PFU/ml、1010PFU/ml的Ad-GFP-nm23-H1处理组和对照组。处理12、24小时在荧光显微镜下观察转染情况。2.RT-PCR鉴定转染48h后nm23-H1基因在ACC-M细胞中的表达并半定量分析转染后ACC-M细胞中VEGF和CD44V6的表达。3.免疫组化分析转染24h后ACC-M细胞中VEGF和CD44V6的表达变化。4.昆明小鼠分PBS组、低、中、高剂量组。分别以含1010PFU/ml的AD-GFP-nm23-H1 PBS稀释液100μ1、200μ1和400μl、PBS 200μl腹腔和肌肉注射。每周采血行肝肾功检测。实验结束,处死小鼠,取心、肝、肺、脾、肾、肌肉等脏器,制做冰冻和HE染色病理切片;做免疫组化,观察病毒体内分布情况和nm23-H1表达情况。并行抗体中和试验,利用病毒特异抗血清中和该种病毒感染性来鉴定抗体滴度的变化。结果:1.转染24h时各组都有明确的可见荧光,1010PFU/ml处理组受转染细胞最多,109PFU/ml处理组较多,108PFU/ml处理组被转染细胞很少,109PFU/ml和1010PFU/ml处理组有明亮的荧光;2. RT-PCR结果示Ad-GFP-nm23-H1处理组中nm23-H1基因条带亮度明显增强,而空病毒载体组和空白组中nm23-H1基因条带亮度无明显变化。3.经凝胶成像分析,结果示处理组VEGF和CD44V6的电泳条带亮度明显暗于空白组和空病毒载体组,进一步分析处理组VEGF、CD44V6的表达水平明显低于对照组4.免疫组化结果,Ad-GFP-nm23-H1处理组nm23-H1在ACC-M细胞中高表达,而VEGF、CD44V6的表达较对照组明显降低。5.动物无中毒症状,无死亡。各组小鼠体重平稳增长,比较差异无统计学意义(P>0.05)。低剂量组(1×1010)第二周的血肌酐,第三周的丙氨酸氨基转移酶(ALT)低于对照组,高剂量组第二周的血尿素氮低于对照组,均具有统计学差异(P<0.05)。其他各组生化指标与对照组之间的差异无统计学意义。在三个剂量组中均有个别小鼠的肝功生化指标高于对照组平均值的两倍。将剂量水平和生化指标升高小鼠数量做卡方检验,P>0.05,按α=0.05水准,小鼠血生化值升高的发生率与剂量水平无明显相关性6.病理结果示各剂量组均有个别小鼠出现轻微病理改变,主要以肝脏病理改变最多见,表现为肝细胞的水样变性、点灶状坏死和中央静脉周围炎细胞浸润。其次是注射部位肌肉表现为肌间炎细胞浸润,偶见肺组织血管周围炎。其余脏器未见明显病理改变。经卡方检验,小鼠轻微病理改变的发生率与剂量水平无明显相关性。冰冻切片荧光显微镜观察显示,腺病毒主要分布于肝脏和肺脏组织中。7.免疫组化检测结果显示,nm23-H1主要在肝脏和肺组织中高表达。8.抗腺病毒抗体中和实验结果示,给药第三周抗体滴度达到高峰,已能完全阻断5×106pfu病毒感染。停药后三周,三组小鼠依然能维持高水平的抗体滴度。停药后第4周(总第七周),第1、2组抗体水平开始下降。结论:1.Ad-GFP-nm23-H1对ACC-M细胞有很强的转染力。2.Ad-GFP-nm23-H1转染ACC-M细胞后nm23-H1能够在ACC-M细胞中稳定高效表达。3.Ad-GFP-nm23-H1转染ACC-M细胞能够显著下调VEGF、CD44V6的表达。4.小鼠对Ad-GFP-nm23-H1具有良好的耐受性,偶有肝功异常和肝损伤等轻微副作用,未见其他明显副作用的产生。5.重复给予Ad-GFP-nm23-H1可诱导产生高滴度的抗腺病毒抗体,但停药后抗体短时间内即可下降。
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