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目 的随着人口老龄化问题日益严重,骨质疏松及其骨折已经成为一种严重影响老年人健康的疾病。已知花色苷类化合物具有抗骨质疏松作用,但目前尚不清楚其对骨质疏松症发展过程有重要作用的成骨细胞增殖或分化的影响。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径对成骨细胞内增殖和分化等信号传递具有重要作用。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-Glucoside,C3G)属于花色苷类物质,在RAW264.7和平滑肌细胞等多种细胞中经MAPK途径调节细胞功能。本次研究拟采用原代人成骨细胞和小鼠成骨细胞MC3T3-E1两种细胞模型,观察C3G对成骨细胞的增殖、分化及MAPK在C3G调节成骨细胞功能过程中的作用。方 法采用来自髋部骨折后行人工股骨头置换术的骨质疏松患者股骨头松质骨组织,通过胶原酶-透明质酸酶消化提取原代成骨细胞,进行传代培养,至第3代使用。茜素红染色诱导矿化实验对提取的细胞进行鉴定。小鼠成骨细胞MC3T3-E1购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。使用MTT 比色法评价不同浓度C3G(0-40μmol/L)处理两种成骨细胞,计算24h、48h、72h时各浓度组细胞增殖率。使用实时无标记细胞分析(Real Time Cell Analysis,RTCA)技术对使用不同浓度C3G(0-200μmol/L)处理的MC3T3-E1细胞的细胞活性进行实时跟踪48h并绘制期间时间-细胞指数曲线。使用ERK1/2特异性抑制剂PD98059、JNK特异性抑制剂SP600125、P38特异性抑制剂SB202192分别预处理两种成骨细胞4h后,使用0μmol/L或100μmol/L浓度C3G处理两种成骨细胞24h并计算各组成骨细胞增殖率。使用不同浓度的C3G(0-200μmol/L)处理人原代成骨细胞7d,茜素红染色后观察矿化结节产生密度。使用不同浓度的C3G(0-200μmol/L)处理MC3T3-E1细胞24h,ELISA法测定骨钙素(Osteocalcin,OC)、Ⅰ型胶原蛋白羧基末端交联(C-Terminal Telopeptide of Type Ⅰ Collagen,CTX-I)水平,比色法测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。使用0μmol/L或lOOμmol/L浓度的C3G处理MC3T3-E1细胞24h,实时荧光定量PCR法测定ALP、Runx2、BMP2 mRNA表达水平;使用如前所述抑制剂预处理方案及C3G处理方案处理后,测定OC、RSK2、ATF4、ATF2、OSX、FOXO1、DLX5 mRNA表达水平;Western Blot法测定ERK1/2、JNK、P38的丰度及磷酸化水平。结 果1.人成骨细胞的分离培养和鉴定股骨头松质骨组织经胶原酶-透明质酸酶消化后获得成骨细胞,原代成骨细胞24h后贴壁,细胞呈梭形,部分区域呈集落生长,细胞爬满瓶底需约7-14d。传代后细胞贴壁时间较原代细胞短,增殖速度较稳定,约7d铺满培养瓶瓶底,细胞呈长梭形和多角形,胞浆丰富,细胞内单核,低倍镜下细胞呈现“涡轮”状生长。诱导矿化处理后,茜素红染色呈阳性。2.C3G处理对MC3T3-E1细胞及人成骨细胞增殖的影响MTT结果显示C3G处理后两种细胞增殖率均上升,C3G各浓度组与对照组相比差异显著(P<0.05)。随着时间延长,C3G各浓度组与对照组之间的差距逐渐减小,在72h时C3G 25μmol/L和500μmol/L浓度组与对照组之间的差距消失(P>0.05),但200μmol/L和400μmol/L对成骨细胞增殖能力依然有一定的增强作用(P<0.05)。RTCA结果显示,C3G提高MC3T3-E1细胞的细胞指数,其中C3G处理的24h时效果明显。3.MAPK信号通路抑制剂预处理后C3G对成骨细胞增殖的影响与DMSO-对照组相比,DMSO-C3G组细胞增殖率显著提高(P<0.001)。在PD98059、SB202192或SP600125处理后,各抑制剂-C3G组与其抑制剂-对照组相比,细胞增殖率均仍旧显著提高(P<0.001)。4.C3G处理对人成骨细胞矿化能力的影响C3G处理7d,人原代成骨细胞钙化结节密度改变,与对照组相比100μmol/L和2000μmol/L组镜下检视可观察到更多红染结构。5.C3G处理对MC3T3-E1细胞ALP、OC和CTX-I的影响在C3G处理24h后,细胞内ALP活性和CTX-1水平随着C3G浓度的增加而略有下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,C3G处理各组OC浓度均显著增加(P<0.05)。6.C3G处理对MC3T3-E1细胞ALP、BMP-2和Runx2 mRNA表达的影响C3G处理的各组与对照组相比,细胞内ALP mRNA水平显著下降,差异倍数(Fold Change,FC)=0.55(P<0.05);BMP mRNA水平无明显改变,FC=1.05(P=0.86);Runx2 mRNA水平显著下降,FC=0.35(P<0.05)。7.抑制剂预处理后C3G对MC3T3-E1 细胞OC、RSK2、ATF4、ATF2、OSX、FOXOl、DLX5 mRNA表达的影响在无抑制剂预处理组中(DMSO-对照组和DMSO-C3G组比较),各基因表达水平:ATF4(FC=1.15,P<0.05)、OC(FC=1.73,P<0.05)、DLX5(FC=1.26,P<0.01)和FOX O1(FC=1.30,P<0.05)。PD98059预处理后C3G组与抑制剂-对照组相比OC(FC=0.99,P=0.93)和ATF4(FC=1.05,P=0.70)mRNA表达水平差异消失。抑制剂-对照组与DMSO-对照组相比RSK2 mRNA水平显著升高(FC=1.90,P<0.01),C3G组无此变化。SB202192预处理后,C3G组与抑制剂-对照组相比OSX(FC=2.11,P<0.01)、DLX5(FC=1.32,P<0.01)表达水平升高。SP600125预处理后,C3G组FOX O1(FC=1.31,P=0.13)和ATF2(FC=1.30,P=0.52)mRNA水平与抑制剂-对照组相比均无明显统计学差异。8.C3G对MC3T3-E1细胞中MAPK通路关键蛋白表达及磷酸化水平的影响C3G处理后ERK1/2磷酸化水平上升(P<0.05),JNK(P=0.27)及P38(P=0.6)磷酸化水平无明显改变。总ERK1/2(P=0.08)、JKN(P=0.31)、P38(P=0.64)水平与对照组相比均无明显改变。结 论1.C3G能够在体外条件下促进人原代成骨细胞和小鼠源成骨细胞株MC3T3-E1增殖。2.C3G能够降低成骨细胞分化早期的标志性蛋白Runx2和ALP的mRNA表达,提高成骨细胞分化晚期的标志性蛋白OC表达,并提高成骨细胞的矿化能力。3.C3G可能通过ERK1/2通路调节成骨细胞分化。