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鱼藤素是一种天然的黄酮类化合物,具有很强的生物活性,在多种肿瘤细胞被证实有强的抑制作用,鱼藤素具有很强的抗肿瘤作用,鱼藤素可有效抑制癌细胞的生长繁殖并杀灭癌细胞,对肺癌细胞增殖的抑制效果较为显著,是一种潜在的天然抗肿瘤药物,具有良好的应用前景。然而实验表明,高剂量的鱼藤素处理下对生物体的神经、心脏、肝、肾系统等都能产生毒害。为探究鱼藤素致毒性的机理,阐明其毒性作用机制,本课题组在前期研究的基础上,选择鱼藤素的毒性机理进行深入的药效研究。通过CCK-8实验筛选鱼藤素作用毒性最强的细胞、赫斯特染色和透射电镜观察鱼藤素对细胞核的损伤情况;AO-EB染色和AnnexinV-FITC/PI双染实验探究鱼藤素对细胞凋亡形态以及细胞凋亡率的影响,并通过RT-qPCR实验和Western Blot实验分别从基因和蛋白水平上探究鱼藤素对Bax和Bcl-2凋亡明星分子的调控作用;同时,通过测定鱼藤素对细胞内氧化应激的影响,包括细胞内活性氧水平、清除自由基的能力和脂质氧化水平的测定;最后,Western Blot实验探究了鱼藤素MAPK/ERK通路中相关蛋白的调控作用,为寻找鱼藤素致毒性作用机制奠定基础。得到结论如下:(1)1.5625μM-100μM的鱼藤素对PC-12、SH-SY5Y、16HBE、LO2和HEK-293T均存在增殖抑制作用,并且能够随着鱼藤素作用浓度增大显著降低细胞的存活率(P<0.05),其中,鱼藤素对PC-12神经细胞增殖抑制效果最明显;(2)赫斯特染色和透射电镜观察到12.5μM,25μM,50μM的鱼藤素可抑制PC-12和SH-SY5Y细胞的生长分化和损伤细胞核;(3)AO-EB染色和Annexin V-FITC/PI双染实验发现12.5μM,25μM,50μM的鱼藤素使细胞形态发生凋亡,极显著增强PC-12和SH-SY5Y细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率,并且RT-qPCR实验和Western Blot实验分别从基因和蛋白水平上验证了鱼藤素能够上调促凋亡分子Bax的表达,下调抗凋亡分子Bcl-2的表达;(4)DCFH-DA染色流式细胞术检测到12.5μM,25μM,50μM的鱼藤素可极显著增强PC-12和SH-SY5Y细胞内ROS水平(P<0.001),并且随着鱼藤素作用浓度增加,细胞内LDH乳酸脱氢酶释放量增加,SOD歧化酶含量降低,脂质氧化标记物MDA丙二醛含量升高等,说明细胞内氧化应激水平明显增加,致使细胞抵御外界损伤能力减弱;(5)Western Blot实验探究了12.5μM,25μM,50μM鱼藤素对MAPK/ERK通路中相关蛋白的调控作用,鱼藤素能够显著地(P<0.05)降低EGF、RAS、CREB、p-MEK、MEK、p-ERK/2、ERK/2蛋白的表达。鱼藤素可能是通过下调MAPK/ERK通路的相关蛋白表达来使细胞活性受损,从而达到致细胞毒性的作用;