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第一部分正常孕期蜕膜CD56+CD16-NK细胞Tim-3-/Tim-3+表达的动态研究 目的 研究整个妊娠过程子宫局部免疫微环境中蜕膜CD56+CD16-NK细胞比例及Tim-3-/Tim-3+表达的动态变化。。 方法 1.取正常孕6-8周的要求人工流产的妇女25例作为早孕期组。取正常的孕14-20周内要求引产的患者13例作为中孕期组,取正常足月剖宫产患者25例作为晚孕期组。取因男方精液异常或者输卵管堵塞导致不孕的正常未孕妇女25例作为对照组;本研究经华中科技大学同济医学院伦理委员会审批,所有研究对象均签署知情同意书; 2.Ficoll密度梯度离心法分离子宫内膜或孕期蜕膜组织单个核细胞; 3.用直接荧光标记流式细胞技术分别检测蜕膜CD56+CD16-NK细胞在整个妊娠过程中比例的阶段性改变,以及CD56+CD16-NK细胞Tim-3-/Tim-3+表达的动态变化。 结果 1.蜕膜中CD56+CD16-NK细胞表达的动态变化 蜕膜组织中各组CD56+CD16-NK细胞比例的表达情况:与对照组(23.22％±6.39%)相比,早孕组、中孕组显著增高(分别为58.10%±6.34%,P<0.05;74.14%±8.67%,P<0.05),晚孕组差异无显著性(15.17%±4.77%,P>0.05);与早孕组相比,中孕组表达增加(P<0.05)。孕期各个阶段CD56+CD16-NK细胞的比例各组之间差异有显著性(P<0.05)。 2.正常孕期蜕膜CD56+CD16-NK细胞中Tim-3-/Tim-3+表达的变化 蜕膜组织中各组Tim-3+占CD56+CD16-NK细胞比例的表达情况:与对照组(70.75%±2.43%)相比,早孕组、中孕组显著降低(分别为45.73%±4.82%,P<0.05;59.16%±3.69%,P<0.05),晚孕组差异无显著性(72.13%±5.84%,P>0.05);蜕膜组织中各组Tim-3-占CD56+CD16-NK细胞比例的表达情况:与对照组(29.56%±2.26%)相比,早孕组、中孕组显著增高(分别为54.68%±4.25%,P<0.05;40.85%±3.31%,P<0.05),晚孕组差异无显著性(28.40%±5.24%,P>0.05)。孕期各个阶段,早孕,中孕,晚孕蜕膜组织CD56+CD16-NK细胞中Tim-3-/Tim-3+比例递进性逐渐降低,其差异有显著性(P<0.01)。 结论 1.早孕期,子宫蜕膜组织中CD56+CD16-NK细胞的比例逐渐升高,至中孕期达高峰后开始下降,晚孕期接近未孕水平。 2.早孕期,子宫蜕膜组织CD56+CD16-NK细胞中Tim-3-比例较Tim-3+高,随着妊娠的发展,Tim-3-比例逐渐下降,而Tim-3+比例逐渐上升,至妊娠末期,Tim-3+比例占主导地位。 第二部分Galectin-9/Tim-3通路对早孕蜕膜CD56+CD16-NK细胞相关功能的影响 目的 在第一部分临床研究的基础上,进一步探讨Gal-9/Tim-3通路对早孕蜕膜CD56+CD16-NK细胞杀伤活性及IFN-γ分泌水平的影响。 方法 1.免疫磁珠法分选蜕膜CD56+CD16-NK细胞,用流式细胞仪鉴定其纯度; 2.进一步流式分选蜕膜CD56+CD16-Tim-3+NK细胞与CD56+CD16-Tim-3-NK细胞; 3.ELISA法检测两者IFN-γ分泌的差异; 4.LDH释放法检测两者杀伤活性的差异; 5.流式检测不同浓度IL-12、IL-18对CD56+CD16-NK细胞活化的影响。 6.ELISA法检测重组Gal-9对体外培养的活化CD56+CD16-dNK细胞IFN-γ分泌的影响,及重组Gal-9与阻断抗体anti-Tim-3联合作用对此类细胞IFN-γ分泌的影响; 7.进一步运用LDH释放法检测重组Gal-9与阻断抗体anti-Tim-3对蜕膜CD56+CD16-NK细胞杀伤活性的影响。 结果 1.免疫磁珠分选后CD56+CD16-NK细胞纯度达98%以上; 2.直接分选出的蜕膜CD56+CD16-Tim-3+NK细胞与CD56+CD16-Tim-3-NK细胞IFN-γ分泌量、杀伤活性均无明显差异(P>0.05); 3.外源性IL-12,IL-18活化后,CD56+CD16-Tim-3+NK细胞IFN-γ分泌量明显上升,差异有显著性(P<0.01);CD56+CD16-Tim-3+占NK细胞比例升高,差异有显著性(P<0.01); 4.重组Gal-9使CD56+CD16-dNK细胞IFN-γ分泌量增多,且呈浓度依赖性(P<0.05);阻断抗体anti-Tim-3可以抑制Gal-9的活化效应; 5.重组Gal-9对蜕膜CD56+CD16-Tim-3+NK细胞杀伤活性的影响无显著性(P>0.05)。 结论 Gal-9/Tim-3通路可以增加CD56+CD16-NK细胞IFN-γ的分泌,但对其杀伤活性无明显影响。 第三部分孕期蜕膜CD56+CD16-NK细胞Tim-3-/Tim-3+表达与病理妊娠相关性研究 目的 研究CD56+CD16-NK细胞在不明原因早期复发性自然流产及子痫前期中的比例变化,以及CD56+CD16-NK细胞Tim-3-/Tim-3+表达的异常改变。 方法 1.取正常孕6-8周要求人工流产的妇女25例作为正常早孕组(早孕组)。取孕8-10周的不明原因早期复发性自然流产17例作为早孕病例组(流产组),取正常足月剖宫产患者25例作为正常晚孕组(晚孕组)。取轻度子痫前期者20例,重度子痫前期者18例作为晚孕病例组(子痫前期组);本研究经华中科技大学同济医学院伦理委员会审批,所有研究对象均签署知情同意书; 2.Ficoll密度梯度离心法分离蜕膜组织单个核细胞; 3.用直接荧光标记流式细胞技术分别检测早孕组与流产组,晚孕组与子痫前期组蜕膜中CD56+CD16-NK细胞比例及CD56+CD16-NK细胞Tim-3-/Tim-3+比例的动态变化。 结果 1.与早孕组(58.10%±6.34%)相比,流产组蜕膜组织中CD56+CD16-NK的比例显著降低(35.12%±4.71%,P<0.05)。 2.与早孕组(45.73%±4.82%)相比,流产组蜕膜组织CD56+CD16-NK细胞Tim-3+比例升高(62.06%±3.21%,P<0.05);与早孕组(54.68%±4.25%)相比,流产组Tim-3-比例降低(38.00%±3.14%,P<0.05);流产组Tim-3-/Tim-3+比例降低,其差异有显著性(P<0.05)。 3.与晚孕组(15.17%±0.77%)相比,子痫前期组蜕膜组织中CD56+CD16-NK细胞比例显著升高(53.21%±6.15%,P<0.05)。 4.与晚孕组(72.13%±5.84%)相比,子痫前期组蜕膜组织CD56+CD16-NK细胞Tim-3+比例降低(47.74%±2.69%,P<0.05);与晚孕组(28.40%±5.24%)相比,子痫前期组Tim-3-比例升高(52.13%±2.68%,P<0.05);子痫前期组Tim-3-/Tim-3+比例升高,其差异有显著性(P<0.05)。 结论 1.流产组蜕膜组织中CD56+CD16-NK细胞比例降低,Tim-3-/Tim-3+比例亦低于正常早孕组。 2.子痫前期组蜕膜组织中CD56+CD16-NK细胞比例升高,Tim-3-/Tim-3+比例亦高于正常晚孕组。