论文部分内容阅读
研究背景:中药柴胡为传统解表药材之一,是伞形科植物柴胡Bupleurum chi nese DC或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd的干燥根。柴胡具有解表退热、升举阳气、疏肝解郁等功效。现代药理学研究表明柴胡的主要药效成分包括柴胡挥发油、柴胡皂苷、柴胡多糖等,其中柴胡挥发油是解热作用的主要活性成分。目前以柴胡挥发油为主要药效成分开发的制剂主要包括柴胡注射剂、柴胡口服液、柴胡鼻腔喷雾剂、柴胡透皮贴剂等,用于治疗流行性感冒、回归热、肺结核发展期的发热等症状。发热是在免疫系统协同神经系统共同作用下,机体对炎症介质损害所做出的一种免疫反应,以体温升高、头痛、乏力等为主要特征。临床常用的非甾体解热抗炎药物主要包括:布洛芬、赖氨匹林、安乃近等,药效剧烈,不良反应多,对于低热患者不宜使用。柴胡注射液作为中药西制的品种,曾被誉为退烧类“明星品种”,但由于注射液成分复杂,与多种药物有配伍禁忌,导致不良反应发生率高,临床应用受限制。本文以柴胡为研究对象研制小儿柴胡退热栓。通过水蒸气蒸馏法提取柴胡挥发油,饱和水溶液法进行包合,最后热熔法制备小儿柴胡退热栓。依据《中国药典》（四部）2020版制剂通则项下栓剂质量标准要求拟定小儿柴胡退热栓的质量标准,并进行初步药效学及解热作用机制研究,为临床应用和药理学研究提供理论基础。研究目的:研制小儿柴胡退热栓,拟定其质量标准,并初步对其药效学及作用机制进行研究。研究方法:1.小儿柴胡退热栓制备研究以柴胡挥发油精提液吸光度为评价指标,以料液比、浸泡时间、提取时间为影响因素,通过三因素三水平正交实验设计优化提取工艺;以柴胡挥发油包合率为评价指标,以β-CD用量、包合温度、包合时间为影响因素,通过三因素三水平正交实验设计优化包合工艺;以柴胡挥发油含量为指标,优化小儿柴胡退热栓的制备工艺。2.小儿柴胡退热栓质量标准研究依据《中国药典》（四部）2020版制剂通则项下栓剂质量检查要求,对小儿柴胡退热栓的性状、重量差异、融变时限、微生物限度进行检查,并以正己醛、正庚醛为指标,采用气质联用（GC-MS）方法测定小儿柴胡退热栓中柴胡挥发油含量,拟定其质量标准。3.小儿柴胡退热栓药效学研究新西兰家兔进行分组,分为空白组（不做处理）、模型组（内毒素+基质栓）、小儿柴胡退热栓组（内毒素+小儿柴胡退热栓）、柴胡注射液组（内毒素+柴胡注射液）、小儿布洛芬栓组（内毒素+小儿布洛芬栓）,除空白组外,其余各组家兔通过耳缘静脉注射内毒素建立发热模型,各组分别给予基质栓、小儿柴胡退热栓（0.8 g/kg）、柴胡注射液（0.6 m L/kg）、小儿布洛芬栓（25 mg/kg）进行治疗。观测各组家兔造模前1 h内、造模后1.5 h及给药后不同时间段行为学和肛温变化;ELISA检测各组家兔造模前、造模后1.5h、给药后1.5 h血浆中白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平和下丘脑中环磷酸腺苷（c AMP）、精氨加压素（AVP）和前列腺素E2（PGE2）水平。4.小儿柴胡退热栓解热作用机制研究THP-1细胞进行分组,分为空白组、LPS组、CH组（8 mg/m L）、LPS+CH组（2 mg/m L）、LPS+CH组（4 mg/m L）、LPS+CH组（8 mg/m L）,通过LPS刺激THP-1细胞建立炎症模型,除空白组外,其余各组分别给予LPS（10μg/m L）、CH（8 mg/m L）、LPS+CH（2 mg/m L）、LPS+CH（4 mg/m L）、LPS+CH（8 mg/m L）,检测各组细胞COX-2、IL-1β蛋白表达及TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2基因表达情况。研究结果:1.小儿柴胡退热栓制备研究柴胡挥发油最佳提取工艺条件为料液比1:10、浸泡时间为8 h、提取时间为2 h;柴胡挥发油最佳包合工艺条件为β-CD用量30g、包合温度为50℃、包合时间为2 h。300 g柴胡饮片,共制得小儿柴胡退热栓（60±2）粒（3批）。2.小儿柴胡退热栓质量标准研究小儿柴胡退热栓呈乳白色子弹型,色泽均匀一致,表面光滑完整细腻,室温下成型性较好;3批次小儿柴胡退热栓总体平均重量为（1.136±0.034）g,总体平均融变时间为（18.20±0.47）min,均未检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌致病菌。GC-MS质谱图结果显示基质和杂质均无干扰,专属性良好,质谱条件符合要求;正己醛、正庚醛在6.19~99.00μg/m L、4.90~78.40μg/m L呈良好的线性关系,相关系数分别为0.998和0.998;精密度RSD分别为1.26%、0.78%;重复性RSD分别为1.35%、2.32%;稳定性RSD分别为2.82%、1.58%;加样回收率分别为97.4%、98.9%,RSD分别为1.84%、1.28%;GC-MS法测定3批小儿柴胡退热栓中正己醛、正庚醛平均含量分别为1.015 mg/10粒、1.145 mg/10粒,因此制定小儿柴胡退热栓中柴胡挥发油最低限度为不得低于0.173 mg/粒。3.小儿柴胡退热栓药效学研究与模型组相比,小儿柴胡退热栓组在给药后1~2.5 h内可显著降低发热家兔肛温至正常水平（P＜0.01）,降低0.82±0.07℃;并且小儿柴胡退热栓能显著下调发热家兔血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α水平（P＜0.05）,分别下调19.13±1.57、33.76±5.82、25.48±9.07 pg/m L;小儿柴胡退热栓可明显下调发热家兔下丘脑中c AMP（P＜0.05）、PGE2水平（P＜0.01）,分别下调1.70±0.19 nmo L/L、79.65±14.99 pg/m L,上调AVP水平（P＜0.01）,上调0.93±0.18 nmo L/L;4.小儿柴胡退热栓解热作用机制研究与空白组相比,LPS组IL-1β、COX-2蛋白表达明显升高（P＜0.001、P＜0.01）,分别上调至0.22±0.02、0.12±0.04;与LPS组对比,LPS+CH组（8 mg/m L）IL-1β、COX-2蛋白表达明显下调（P＜0.01、P＜0.05）,分别下调至0.08±0.01、0.04±0.02。与空白组相比,LPS组IL-1β、TNF-α、COX-2、PGE2（P＜0.01、P＜0.001、P＜0.0001）基因表达明显上调,分别上调10.90±0.14、8.17±0.05、3.90±0.23、2.20±0.10;与LPS组对比,LPS+CH组（8 mg/m L）预处理THP-1细胞后IL-1β、TNF-α、COX-2、PGE2（P＜0.01、P＜0.001、P＜0.0001）基因表达明显下调,分别下调10.10±0.15、5.89±0.03、4.10±0.04、2.05±0.14。研究结论:1.小儿柴胡退热栓的制备工艺合理可行,符合《中国药典》（四部）2020年版制剂通则质量标准要求。GC-MS可作为小儿柴胡退热栓中柴胡挥发油的含量测定方法。2.小儿柴胡退热栓解热效果显著,解热作用机制可能与通过调节IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、PGE2等炎性因子和发热介质水平的表达有关。