机体免疫系统具有识别异常突变的细胞或肿瘤细胞的作用，可监视肿瘤的发生并通过细胞免疫机制杀伤肿瘤。树突状细胞(dendritic cell，DC)是体内功能最强的专职抗原提呈细胞(APC)，能摄取和加工递呈抗原，具有强大的激活CD8+细胞毒性T细胞及CD4+辅助性T细胞的能力，控制着体内免疫反应的过程，在免疫应答中处于中心地位。DC被认为是发展抗肿瘤疫苗治疗的理想工具，大量的临床试验也已经评价了DC肿瘤疫苗用于肿瘤患者的安全性和有效性。但是DC可以诱导产生效应和记忆T细胞，也可以产生耐受型T细胞，其原因及机制至今尚不清楚。　　 单核细胞(monocytes)是机体重要的杀伤肿瘤细胞的免疫细胞，是DC和巨噬细胞的前体细胞。具有吞噬杀伤、呈递抗原启动免疫应答、抗肿瘤、调节免疫等作用。人类外周血单核细胞根据是否表达CD16主要分为CD14+CD16-和CD14+CD16+两个亚群。表达CD16的单核细胞又可细分为CD14++CD16+和CD14+CD16+两个亚群。研究发现单核细胞各亚群在细胞因子的分泌、抗原递呈、迁移、体外诱导分化的DC功能等方面都不相同。特别是CD16+单核细胞来源的DC(16+mDC)刺激初始T细胞产生较高水平的IL-4，诱导T细胞向Th2方向极化。而CD16-单核细胞来源的DC(16-mDC)则刺激T细胞产生高水平IL-12，诱导Th1免疫反应。这些结果提示不同表型的单核细胞可能在肿瘤免疫中的作用也不相同，但目前这方面的研究仍未有报道。　　 健康人外周血CD14+CD16+单核细胞占单个核细胞的2.2％，占CD14+单核细胞的13％。在各种炎症性疾病如脓毒血症，哮喘和动脉粥样硬化等疾病中CD14+CD16+单核细胞显著增加。有研究发现晚期胃癌患者外周血中CD14+CD16+单核细胞比例增加到40％以上，但这群单核细胞增加的机制以及与肿瘤发生风险的相关性等方面的研究仍无报道。　　 肿瘤细胞可以模拟淋巴结特点创造一个免疫耐受的微环境，以利于肿瘤细胞更好的逃避机体免疫系统攻击。趋化因子是一类低分子量的细胞因子，能够选择性结合和激活不同类型的细胞。它在肿瘤免疫活动中发挥了双重作用，一方面会增加宿主天然或特异性抗肿瘤免疫，另一方面又可能会促进肿瘤生长和转移。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是免疫细胞产生的关键趋化因子之一，过表达在乳腺肿瘤及其他肿瘤细胞。MCP-1可以通过增加有害性肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的存在或抑制抗肿瘤T细胞的活性破坏宿主抗肿瘤免疫与肿瘤免疫耐受之间的平衡。MCP-1能否影响单核细胞异质性还不清楚。　　 我们猜测单核细胞异质性可能在乳腺癌的免疫病理中发挥重要作用，并且MCP-1可能是肿瘤患者CD14+CD16+单核细胞增加的原因。我们首先检测并比较了乳腺癌患者与健康人外周血CD14+CD16+和CD14+CD16-单核细胞的分布情况，其次体外实验研究了乳腺癌细胞系MCF-7细胞上清对单核细胞表型的影响，最后探讨了MCF-7肿瘤上清中的MCP-1对单核细胞异质性的调控作用。本研究的结果为肿瘤免疫耐受机制的研究及自体DCs疫苗疗法的疗效提高提供有价值的数据及新的研究思路。　　 第一部分：乳腺癌患者外周血单核细胞各亚群水平及临床意义　　 目的:　　 研究乳腺癌患者及健康对照组外周血及肿瘤组织中CD14+CD16+和CD14+CD16-单核细胞亚群的水平，分析乳腺癌患者外周血升高的CD14+CD16+单核细胞与患者临床病理的相关性，探讨CD14+CD16+单核细胞在乳腺癌的发生发展中所起的作用。　　 方法:　　 1、乳腺癌患者及健康对照组外周血中CD14+CD16+和CD14+CD16-单核细胞亚群的比例检测:采集乳腺癌患者及健康对照组外周静脉抗凝血，流式细胞学方法检测CD14+CD16+和CD14+CD16-单核细胞亚群的分布比例。　　 2、肿瘤组织中CD14+CD16+和CD14+CD16-单核细胞亚群的比例检测:通过研磨将肿瘤组织制成单细胞悬液，密度梯度离心后获得单个核细胞，流式细胞学方法检测CD14+CD16+和CD14＋CD16-单核细胞亚群的分布比例。　　 3、乳腺癌患者外周血升高的CD14+CD16+单核细胞与患者临床病理的相关性分析:使用ROC曲线分析CD14+CD16+单核细胞在乳腺癌辅助诊断中的作用，并使用可变剪切值分析此指标的灵敏度和特异性。采用双尾λ2检验对乳腺癌患者各亚组与患者临床病理资料之间进行比较。　　 结果:　　 1、外周血CD14+CD16+和CD14+CD16-单核细胞亚群的水平:乳腺癌患者外周血中CD14+CD16+单核细胞平均为16.96％，明显高于健康对照组(10.84％)(P＜0.0001)。而CD14+CD16-单核细胞的水平在乳腺癌患者和健康对照组中没有明显差异（P＞0.05）。　　 2、肿瘤组织中CD14+CD16+和CD14+CD16-单核细胞亚群的水平:肿瘤组织中存在一定比例的CD14+CD16+单核细胞。　　 3、乳腺癌患者外周血的CD14+CD16+单核细胞与患者临床病理的相关性分析:乳腺癌患者及健康对照组外周血CD14+CD16+单核细胞的比较数据显示ROC曲线下面积(AUC)为0.805(P=0.0001)。当切点(13.31％)作为截点值时，整体样本作为早期诊断指标的灵敏度为68.7％，特异度为79.6％。乳腺癌患者外周血CD14+CD16+单核细胞≤13.31％组与CD14+CD16+单核细胞＞13.31％组在肿瘤大小和病理分期方面存在显著相关性(P＜0.05)，而与患者年龄，是否绝经，淋巴结转移，雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)表达，人表皮生长因子2(HER2)表达等无相关性(P＞0.05)。早期乳腺癌患者或肿瘤体积较小(T1-T2)的患者外周血CD14+CD16+单核细胞水平较高。特别是I期乳腺癌患者外周血CD14+CD16+单核细胞平均水平达19.39％。　　 结论:　　 1、具有促炎作用的CD14+CD16+单核细胞在乳腺癌患者外周血升高，升高的这群单核细胞可以迁移到肿瘤组织局部，发挥重要的免疫调节作用。　　 2、升高的CD14+CD16+单核细胞与肿瘤大小和肿瘤病理分期呈负相关，即越早期和肿块越小的乳腺癌患者CD14+CD16+单核细胞平均水平越高，这说明升高的这群单核细胞可能与乳腺癌的肿瘤发生有关，而与肿瘤进展及预后可能无关。　　 3、外周血CD14+CD16+单核细胞的水平作为乳腺癌早期诊断的指标具有一定的灵敏度和特异性，将来有可能成为肿瘤早期诊断的有用指标。　　 4、肿瘤微环境中一定存在某些因素诱导或扩增了CD14+CD16+单核细胞，使其在肿瘤患者的水平升高。　　 第二部分：乳腺癌患者CD14+CD16+单核细胞升高的机制研究　　 目的:　　 体外实验研究乳腺癌细胞上清及上清中的细胞因子对单核细胞亚群的调控作用，探讨乳腺癌患者CD14+CD16+单核细胞升高的机制。　　 方法:　　 1、健康人外周血单核细胞的分离:无菌采集健康志愿者外周静脉抗凝血，采用Ficoll密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(PBMC)，免疫磁珠分选法分离纯化外周血CD14+单核细胞。　　 2、人乳腺癌细胞系MCF-7细胞上清(MCF-CM)的制备:取对数生长期的MCF-7细胞，调整细胞浓度为2×106/75cm2进行铺板，细胞贴壁生长到融合度达60-70％时更换新鲜培养基继续培养48小时，收集上清备用。　　 3、肿瘤上清MCF-CM对单核细胞亚群调控的检测:体外新分离纯化的健康志愿者外周血CD14+单核细胞作为原代单核细胞，分不同浓度MCF-CM刺激组和对照组，常规培养24小时，流式细胞学检测CD14+CD16-单核细胞和CD14+CD16+单核细胞的变化。　　 4、人重组细胞因子对单核细胞亚群调控的检测:体外新分离纯化的健康志愿者外周血单核细胞，分别以重组的人TNF-α，IL-2，骨桥蛋白(OPN)，MCP-1进行刺激，继续培养24小时，流式细胞学检测CD14+CD16-单核细胞和CD14+CD16+单核细胞的变化。　　 5、MCP-1分泌水平的检测:分别留取单核细胞，MCF-CM，MCF-CM刺激单核细胞组上清，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞培养上清中MCP-1的浓度。　　 6、anti-MCP-1mAb对单核细胞亚群调控的检测:体外新分离纯化的健康志愿者外周血单核细胞，分25％MCF-CM组、anti-MCP-1mAb组、25％MCF-CM+anti-MCP-1mAb作用组和对照组，常规培养24小时，流式细胞学检测CD14+CD16-单核细胞和CD14+CD16+单核细胞的变化。　　 结果:　　 1、肿瘤上清MCF-CM对单核细胞亚群的调控:培养体系中含体积比25％的MCF-CM时与对照组相比，CD14+CD16+单核细胞的比例增加近3倍，50％和75％MCF-CM组CD14+CD16+单核细胞的比例增加近5倍，而CD14+CD16-单核细胞比例下降(P＜0.05)。　　 2、人重组细胞因子对单核细胞亚群的调控:体外单核细胞经人重组TNF-α，IL-2，OPN，MCP-1蛋白刺激24小时，TNF-α，IL-2，OPN刺激组与对照组相比，CD14+CD16-单核细胞和CD14+CD16+单核细胞比例无明显改变(P＞0.05)，但MCP-1组CD14+CD16+单核细胞比例明显增加(P＜0.05)，而且这种增加存在浓度依赖性。　　 3、MCP-1的分泌水平:25％MCF-CM作用体外新分离纯化的健康志愿者外周血单核细胞24小时，上清中的MCP-1水平明显高于单核细胞组和肿瘤细胞上清MCF-CM组(P＜0.05)。　　 4、anti-MCP-1mAb对单核细胞亚群的调控作用:MCF-CM可明显升高CD14+CD16+单核细胞，当同时加入anti-MCP-1mAb后可以抑制CD14+CD16+单核细胞的增加(56.43％降至43.09％，P＜0.05)。　　 结论:　　 1、体外培养的MCF-7细胞上清能够显著增加CD14+CD16+单核细胞水平，并且随培养体系中MCF-CM比例的增加，其对CD14+CD16+单核细胞升高的作用越明显。　　 2、体外人重组MCP-1抗体能够显著增加CD14+CD16+单核细胞水平，并且这种升高作用存在浓度依赖性。　　 3、体外培养的MCF-7细胞上清会刺激单核细胞分泌较高水平的MCP-1。而且抗anti-MCP-1mAb会抑制肿瘤上清对CD14+CD16+单核细胞的上调，这MCP-1可能是乳腺癌患者CD14+CD16+单核细胞增加的原因之一。