香椿Toona sinensis Roamer（T.sinensis）为被子植物门（Angiospermae）楝科（Me1iaceae）香椿属（Toona）植物,其叶和果实具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等生物活性,为了更为深入地探讨其药效物质基础,并为香椿叶和香铃子药材的质量控制和评价提供指标性成分和科学依据,有必要开展化学成分的分离与鉴定、活性成分的检验与分析等研究工作。中药中获取的苷元或稀有次级苷类化学成分具有更强的生物活性及应用价值,为克服传统酸水解或酶水解法存在的不足,本文以香椿叶提取物、薯蓣皂苷和淫羊藿原生苷为研究对象,构建并优化新型催化水解体系,用于更加高效、方便地制备中药活性成分。第一章文献综述对香椿的植物学特征、药用与食用价值、香椿药用部位的化学成分（多酚类、萜类、苯丙素类、含硫化合物等）研究进展进行综述,并阐述了香椿提取物及化学成分的生物活性。此外,探讨了中药活性成分的制备新途径,并论证了建立新方法的必要性。在充分调研的前提下,提出本论文的立题依据和设计思路,为论文工作的开展奠定理论基础。第二章香椿的化学成分研究利用有机溶剂提取、常压柱色谱、制备高效液相色谱等提取、分离与纯化技术对香铃子、香椿叶中的化学成分进行了分离和纯化,共计获得了23个单体化合物,通过理化方法以及紫外、电喷雾质谱、¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱等波谱方法鉴定了其化学结构,分别为正十二烷（S1）、木蜡酸（S2）、β-谷甾醇（S3）、豆甾醇（S4）、香草醛（S5）、山柰酚（S6）、槲皮素（S7）、没食子酸甲酯（S8）、没食子酸乙酯（S9）、没食子酸（S10）、4-甲基-7-羟基香豆素（S11）、1,2,3,6-四-O-没食子酰-β-D-吡喃葡萄糖苷（L1）、1,2,3,4,6-五-O-没食子酰-β-D-吡喃葡萄糖苷（L2）、（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯（L3）、（+）-儿茶素（L4）、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（L5）、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷（L6）、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（L7）、山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷（L8）、芸香苷（L9）、杨梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷（L10）、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷（L11）和槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷（L12）,其中18个化合物为多酚类化学成分。经检索发现,化合物S1、S2、S5、S8、S11、L3、L4和L11为首次从该植物中分离得到,其中S1、S2、S11和L11则为首次从香椿属植物中分离得到。第三章香椿叶中多酚类化合物的含量测定香椿的化学成分研究表明,多酚类化合物是香椿叶中活性物质基础的重要组成部分,有必要对香椿叶中各种多酚类化合物的含量进行测定,为其质量评价提供相应的检测手段。1.香椿叶中没食子酸和没食子酸甲酯的含量测定。采用内标法建立了RP-HPLC-UV测定香椿叶中没食子酸和没食子酸甲酯含量的分析技术,并进行方法学验证。结果显示,没食子酸和没食子酸甲酯分别在4.164μg/mL²08.2μg/mL、4.972μg/mL²49.8μg/mL范围内,峰面积比与浓度的线性关系良好,相关系数r²分别为0.9998和0.9999;其日间与日内精密度处于0.98%¹.74%,且供试品溶液在24 hrs内测定结果稳定;没食子酸含量的RSD为1.26%（n=6）,没食子酸甲酯含量的RSD为1.42%（n=6）,可见该方法的重复性良好;被分析物的平均加样回收率介于97.3%¹02.8%,RSD为2.16%⁴.26%（n=3）,可见该方法具有较高的准确度。利用该方法对五批香椿叶进行检测后发现,山东烟台产香椿叶中两者的总含量远远高于其他四批,而江苏镇江则为最低,排序为山东烟台>河南驻马店、山西运城、四川绵阳>江苏镇江。2.香椿叶中芸香苷的HPLC-UV含量测定。建立了HPLC-UV法分析香椿叶中芸香苷含量的技术,并进行方法学验证。结果显示,芸香苷在10.44μg/mL²61.0μg/mL浓度范围内,峰面积与浓度的线性关系良好,相关系数r²为1.0000;其精密度处于0.58%⁰.96%,且供试品溶液在72 hrs内测定结果稳定;芸香苷含量的RSD为1.63%（n=6）,可见该方法的重复性良好;平均加样回收率介于100.7%¹01.6%,RSD为2.03%³.53%（n=3）,可见该方法具有较高的准确度。利用该方法对两批香椿叶进行了分析,芸香苷的含量分别为0.673±0.010 mg/g和0.498±0.005 mg/g。芸香苷具有抗氧化活性、免疫调节等生物效应,对照品易得、价廉,可作为香椿叶的指标性成分;同时,本方法简便、可靠,适合在实验室等场所作为常规检测技术应用于香椿叶质量控制与评价。3.不同产地、不同采收月份香椿叶中黄酮醇苷的含量测定。建立了UPLC-UV同时测定香椿叶中八种黄酮醇苷（L5^L12）含量的方法,并比较不同产地、不同采收月份香椿叶中这八种黄酮醇苷含量的变化。结果显示,八种黄酮醇苷（L5^L12）在相应范围内呈现良好的线性关系,相关系数r²均>0.9992;精密度实验的RSD值处于0.45%¹.86%（n=6）,表明方法的精密度良好;稳定性实验结果表明供试品溶液在72 hrs内测定结果稳定;测得八种黄酮醇苷含量的RSD介于1.33%².94%（n=6）,可见该方法的重复性良好;八种黄酮醇苷的平均加样回收率介于95.8%¹04.3%,RSD为0.84%⁴.61%,方法具有较高的准确度。十个不同产地采集的香椿叶中八种黄酮醇苷的含量分析结果显示,八种黄酮醇苷的总含量介于3.667 mg/g¹3.824 mg/g,其中L6的含量在所有十个批次样品中均为最高,L5和L8的含量次之。连续采收十个月份香椿叶中八种黄酮醇苷的含量分析结果显示,其总含量介于0.976 mg/g⁵.748 mg/g,且含量于3月已达到较高水平,并且于4月、5月或6月先后达到峰值后逐步降低,直至12月时降至最低点。考虑到香椿在3、4月期间以产出香椿芽为主,而5、6月时香椿叶生长茂盛,产量更大,适宜大量采收。差异性分析及相关性分析结果显示,不同产地香椿叶中黄酮醇苷的含量存在显著性差异,且八种黄酮醇苷之间普遍存在相关性。第四章双相酸水解萃取-HPLC-UV测定香椿叶中槲皮素与山柰酚的研究直接测定香椿叶中八种黄酮醇苷的方法所需对照品花费的代价较大,且对测定条件的要求较高,不适于香椿叶的常规检测。本章构建了双相酸水解法萃取槲皮素和山柰酚,并通过HPLC-UV对两种黄酮苷元进行定量分析,以期为香椿叶的质量控制与评价提供更为便捷的方法。1.双相酸水解萃取香椿叶中的槲皮素与山柰酚。构建了双相酸水解体系从香椿叶中萃取黄酮苷元槲皮素与山奈酚;采用单因素实验考察了有机溶剂、硫酸浓度、水解温度和水解时间对槲皮素和山柰酚得率的影响并进行了优化。结果表明,在香椿叶60%乙醇提取物中加入4%硫酸水溶液50 mL,超声3 mins混悬,再加入三氯甲烷50 mL,置于80℃水浴中加热回流1 hr,所测定的槲皮素和山柰酚的含量最高,分别达到0.228%和0.091%。此外,将建立的双相酸水解法与传统酸水解方法进行比较,结果表明槲皮素和山柰酚的得率分别提高了39.0%和44.4%;与此同时,硫酸溶液的浓度得以大幅降低,且酸水解与萃取同步,简化了操作步骤,优势明显。2.HPLC-UV测定香椿叶中槲皮素与山柰酚的含量。建立了香椿叶中槲皮素与山柰酚的HPLC色谱分析技术,并进行方法学验证。结果表明,槲皮素、山柰酚与杂质均达到基线分离,保留时间合理,色谱峰对称性好;槲皮素与山柰酚在0.6250μg/mL⁴0.00μg/mL浓度范围内线性关系良好（r²=0.9999）;精密度试验所得RSD<2%,表明仪器的精密度良好;稳定性试验结果表明在48 hrs内香椿叶供试品溶液的性质稳定（RSD<2%）;槲皮素和山柰酚的平均加样回收率介于99.6%¹02.5%,RSD为0.49%².73%,方法具有较高的准确度。对十个产地香椿叶中槲皮素和山柰酚的含量进行了测定与比较,发现所有产地香椿叶中槲皮素的含量均明显高于山柰酚;山东菏泽产香椿叶中槲皮素的含量远高于其他产地,且两种黄酮苷元的总含量亦为最高,而江苏南京产香椿叶中山柰酚的含量则为最高;山东青岛产香椿叶中槲皮素和山柰酚的含量均为最低,分别为0.212%和0.023%。第五章加压液体萃取-加压双相酸水解法制备薯蓣皂苷元的研究在双相酸水解法从香椿叶中制备黄酮苷元槲皮素和山柰酚的基础上,本章构建并优化了加压液体萃取-加压双相酸水解技术,更加高效、清洁地从中药穿龙薯蓣中制备薯蓣皂苷元。1.HPLC-UV法测定薯蓣皂苷元的含量。建立了可靠、准确地测定薯蓣皂苷元含量的HPLC分析技术,并进行方法学验证。实验结果表明,穿山龙供试品溶液中的薯蓣皂苷元可以与各干扰组分达到基线分离（R>1.5）,色谱峰对称性好;薯蓣皂苷元在0.01211 mg/mL¹.550 mg/mL范围内线性关系良好,r²=0.9999;方法的精密度（RSD<2%）和重复性（RSD=1.86%）良好;平均加样回收率介于99.7%¹01.6%,RSD为1.07%³.63%,可见方法具有较高的准确度;稳定性试验结果表明在72 hrs内供试品溶液的性质稳定（RSD<2%）。本章所建立的色谱分析方法简便、可靠,适合于薯蓣皂苷元的含量测定。2.加压液体萃取法从穿山龙中获取薯蓣皂苷的研究。建立了加压液体萃取法从穿山龙中获取薯蓣皂苷的技术;以薯蓣皂苷得率为指标,采用单因素实验对萃取温度、料液比、乙醇浓度、样品量等加压液体萃取法的条件进行了优化。结果表明,最佳萃取条件为萃取温度为80℃,料液比为1:25 g/mL,乙醇浓度为60%,载入样品量为8.0 g。与三种传统方法进行比较,采用加压液体萃取法时薯蓣皂苷的得率（9.10%）与索氏抽提法接近,分别比加热回流法和超声提取法高5.3%和10.2%;同时,乙醇总消耗量（mL/g）比索氏抽提法减少了24.7%;此外,加压液体萃取法的总耗时量（hrs）分别比索氏抽提法和加热回流法大幅减少了93.1%和44.5%。由此可见,本章节研究中采用加压液体萃取法从穿山龙中萃取薯蓣皂苷是一种得率更高、更为经济的途径。3.加压双相酸水解薯蓣皂苷制备薯蓣皂苷元的研究。基于加压液体萃取法获取了薯蓣皂苷后,进一步建立了加压双相酸水解技术以获取薯蓣皂苷元;采用单因素实验,以薯蓣皂苷元的得率和硫酸消耗量为指标,对水解温度、硫酸浓度、搅拌速度和水解时间等影响因素进行了考察;在单因素试验基础上,采用正交实验设计对加压双相水解条件进行优化。实验结果表明,当水解温度为150℃,搅拌速度为100 rpm,硫酸浓度为4μL/mL,水解时间为2.0 hrs时薯蓣皂苷元得率最高。正交实验结果显示,三个影响因素的主次顺序依次为:水解温度（A）>硫酸浓度（B）>水解时间（C）。与三种传统方法进行比较,采用新方法（加压液体萃取—加压双相酸水解法）获取薯蓣皂苷元的得率为1.86%,分别比直接酸水解法、索氏抽提—常压酸水解法和双相联合酸水解法的得率增加了53.7%、37.8%和4.49%,且硫酸消耗量和耗时量大幅降低。由此可见,本章节研究中建立的加压液体萃取—加压双相酸水解法是一种更为高效、清洁的制备薯蓣皂苷元的新途径。第六章双相酶水解制备宝藿苷I和箭藿苷B的研究本章研究中,建立了一种新型双相酶水解体系并应用于转化淫羊藿原生黄酮苷（淫羊藿苷和朝藿定B）制备宝藿苷I和箭藿苷B,然后对酶水解反应条件以及双相酶水解体系进行了优化,构建了更为便捷、高效地制备淫羊藿稀有黄酮苷的关键技术。1.双相酶水解淫羊藿苷制备宝藿苷I的研究。建立了淫羊藿苷和宝霍苷I的HPLC分析方法;采用单因素实验考察了常规酶水解反应中缓冲液pH值、酶水解时间、酶与底物质量比和酶水解温度对淫羊藿苷水解率的影响;构建了双相酶水解体系水解淫羊藿苷制备宝藿苷I,并考察了有机溶剂、底物量以及有机溶剂/缓冲液体积比对淫羊藿苷水解率和宝藿苷I萃取率的影响。结果表明,在建立的色谱分析条件下淫羊藿苷和宝霍苷I分离良好,色谱峰对称性好,在相应浓度范围内线性关系良好。常规酶水解宝霍苷适宜条件为:缓冲液pH 4.0,酶水解时间为6 hrs,酶与底物质量比为1?1,酶水解温度为55℃;在该条件下,淫羊藿苷被β-葡萄糖苷酶完全转化为宝藿苷I。进一步筛选得到双相酶水解体系的优化条件为:乙酸乙酯为有机相,乙酸乙酯/缓冲液体积比为5:1。此外,还考察了双相酶水解体系的重复使用性能,结果表明酶溶液及有机相在连续使用了4次之后,淫羊藿苷的水解率仍高于80%。50倍放大实验结果显示双相酶水解体系连续使用三次后,淫羊藿苷水解率为88.6%,宝藿苷I萃取率为95.2%,预计收益4957.50元/30 g宝藿苷I。与常规酶水解法比较,通过双相酶水解可以使淫羊藿苷水解率提高2.2%,淫羊藿苷处理量增加1倍,由此可见,新建立的双相酶水解法是一种更为高效、便捷地水解淫羊藿苷制备宝藿苷I的方法。2.双相酶水解朝藿定B制备箭藿苷B的研究。建立了朝藿定B和箭藿苷B的HPLC分析方法;采用单因素实验考察了常规酶水解朝藿定B反应中水解酶、酶与底物质量比、酶水解时间、反应温度、缓冲液pH和金属离子对朝藿定B水解率的影响;构建了双相酶水解体系水解朝藿定B制备箭藿苷B,并考察了有机溶剂、酶水解时间和有机溶剂/缓冲液体积比对朝藿定B水解率和箭藿苷B萃取率的影响。结果表明,建立的色谱分析条件下朝藿定B和箭藿苷B分离良好,色谱峰对称性好,在相应浓度范围内线性良好（r²>0.9997）。常规酶水解朝藿定B适宜条件为:β-葡聚糖酶为水解酶,酶与底物质量比为1:2,酶水解时间为40mins,反应温度为60℃,缓冲液pH为4.5。进一步优化得到双相酶水解的条件为:乙酸丙酯为有机相,乙酸丙酯/缓冲液体积比为1:1,酶水解时间为1 hr。此外,还考察了双相酶水解体系的重复使用性能,结果表明酶溶液及有机相在连续使用了7次之后,朝藿定B的相对水解率仍高于85%,表明该方法能高效、经济地水解朝霍定B制备箭霍苷B。