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甘蔗(Saccharum spp.hybrid)是我国乃至世界最重要的糖料作物,甘蔗花叶病(sugarcane mosaic disease,SMD)是严重危害甘蔗生产的病毒性病害之一,在全世界蔗区普遍发生。SMD的病原主要是甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)和高粱花叶病毒(Sorghummosaicvirus,SCMV)。和 SrMV属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。该属病毒为正义单链RNA病毒,其基因组5’端没有帽子结构,由病毒自身编码的基因组连接蛋白(virus genome-linked protein,VPg)行驶帽子功能,与真核翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)互作,启动病毒的复制。利用 RNA 干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默与 potyvirus 互作的eIF4 或eIF(iso)4E基因,可以阻断病毒的复制,使转基因植物产生对病毒的广谱抗性,转基因植物可以正常生长并完成生命周期。目前在植物中发现的14个隐性抗病基因都是eIF4E基因的突变体。在甘蔗上,SCMV侵染的分子机制研究尚属空白,甘蔗eIF4E基因的克隆及其与SCMV-VPg互作的研究还尚未有文献报道。鉴于此,本研究开展了以下工作:1.甘蔗eIF4E基因和SCMV-VPg克隆以甘蔗叶片为材料提取RNA,通过反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和 cDNA 末端快速扩增技术(rapid amplication of cDNA ends,RACE)获得了 3个甘蔗eIF4E基因。其中,Sc-eIF4E1、Sc-eIF4E3得到了全长序列,Sc-eIF4E2得到了开放读码框(open reading frame,ORF)。Sc-eIF4E1 全长 886 bp,ORF为 663 bp,编码220个氨基酸;Sc-eIF4E2长度为 786bp,ORF为 633bp,编码210个氨基酸;Sc-eIF4E3全长为978 bp,ORF为690bp,编码229个氨基酸。以本实验室试验田中感染SCMV的甘蔗叶片为材料,克隆了S MV-VPg基因,其长度为567 bp,编码189个氨基酸。2.甘蔗eIF4E与SCMV-VPg互作验证利用酵母双杂交系统(yeast two hybrid system,Y2HS)验证了 SCMV-VPg与Sc-eIF4E1、Sc-eIF4E2、Sc-eIF4E3的互作。分别构建含SCMV-VPg基因的诱饵载体和Sc-eIF4E1、Sc-eIF4E2、Sc-eIF4E3基因的捕获载体,共转化NMY51酵母菌株,通过营养缺陷型培养和显色反应验证其互作。结果表明:SCMV-VPg与Sc-eIF4E1、Sc-eIF4E2、Sc-eIF4E3均发生互作,且Sc-eIF4E1的互作强度最强,Sc-eIF4E3 次之,Sc-eIF4E2 最弱。利用双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)验证了 SCMV-VPg 与 Sc-eIF4E1、Sc-eIF4E2、Sc-eIF4E3 的互作。分别构建SCMV-VPg 基因的 Yn-VPg、Yc-VPg 载体与 Sc-eIF4E1、Sc-eIF4E2、Sc-eIF4E3基因的 Yn-Sc-eIF4E1、Yc-Sc-eIF4E1、Yn-Sc-eIF4E2、Yc-Sc-eIF4E2、Yn-Sc-eIF4E3、Yc-Sc-eIF4E3载体,转化农杆菌EHA105菌株获得阳性转化菌株。通过农杆菌注射法注射本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片,培养48-60h后在激光共聚焦显微镜下观察蛋白互作情况。结果表明:SCMV-VPg与Sc-eIF4E1、Sc-eIF4E2、Sc-eIF4E3在本氏烟表皮细胞中均发生互作,结果与酵母双杂交结果一致。3.甘蔗Sc-eIF4E基因定量表达研究利用Real-time PCR技术在mRNA水平检测健康甘蔗与感病甘蔗Sc-eIF4E的表达情况,结果表明:Sc-eIF4E1、Sc-eIF4E2、Sc-eIF4E3基因在SCMV侵染的甘蔗叶片中的表达上调。综上所述,本研究克隆了 3个甘蔗翻译起始因子基因,并利用Y2HS和BiFC验证了其与SCMV-VPg的互作。本研究首次开展了 SCMV与甘蔗互作分子机制的研究,为通过RNAi技术沉默甘蔗翻译起始因子基因创制具有花叶病广谱抗性的甘蔗新种质提供了分子改良靶点。本研究对于发展甘蔗转基因抗病育种新策略,促进作物育种和植物保护交叉学科的发展,具有重要的科学意义和应用价值。