论文部分内容阅读
鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A ovirus.DHAV)是一种无囊膜包裹的单股正链RNA病毒,其基因组仅一个开放阅读框(Open reoding frame,ORF),共编码3种结构蛋白和9种非结构蛋白,主要有3个基因型(DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3),其中DHAV-2主要在台湾等地区流行,我国大陆地区未见报道,而DHAV-1和DHAV-3在我国普遍流行,且存在混合感染的情况,为该病的诊断治疗增加了难度,为建立简便、快速、应用范围广的DHAV-3抗体检测方法,本研究主要针对DHAV-3 VP2和VP4基因进行原核表达,并基于VP2和VP4融合蛋白建立了 DHAV-3间接ELISA检测方法,所获得的主要结果如下:1.DHAV-3VP2和VP4基因的原核表达、优化、纯化。本试验以DHAV-3尿囊液中抽提的RNA为模板,通过RT-PCR技术得到与预期结果一致的VP2和VP4目的基因片段,分别克隆至pET30a-(+)、pET32a-(+)原核表达载体,分别转化至宿主表达菌BL21(DE3),经过温度、IPTG浓度优化,SDS-PAGE结果分析表明,融合蛋白VP2主要以包涵体的形式表达,在37℃,0.8 mmol/LIPTG条件下诱导表达量最大,经切胶纯化可得到较高纯度的融合蛋白VP2;融合蛋白VP4主要以可溶性表达的形式存在,在37℃,0.4 mmol/L IPTG条件下诱导表达量最大,经Ni2+柱亲和层析的方法可得到较高纯度的融合蛋白VP4。Western blot分析结果表明融合蛋白VP2和VP4能特异性结合兔抗DHAV-3血清,说明它们具有良好的反应原性。2.基于纯化的VP2和VP4蛋白建立间接ELISA检测方法分别以纯化后的重组蛋白VP2和VP4为包被抗原,经过抗原包被浓度、酶标二抗稀释度、包被条件、封闭条件、血清孵育时间、酶标二抗时间、显色时间等进行一系列优化,分别建立基于VP2和VP4蛋白的DHAV-3间接ELISA检测方法。试验结果表明,基于VP2蛋白的ELISA检测方法最佳包被浓度为2.23μg/mL,37℃孵育1h后4℃包被过夜,1%脱脂牛奶封闭1 h,血清1:160稀释后孵育1 h,HRP标记的兔抗鸭IgG 1:2000稀释后孵育0.5 h,单组份TMB显色10 min为最佳反应条件,并确定阳性阈值为0.25;基于VP4蛋白的ELISA检测方法最佳包被浓度为2.6μg/mL,37℃孵育1h后4℃包被过夜,5%脱脂牛奶封闭1h,血清1:20稀释后孵育0.5 h,HRP标记的兔抗鸭IgG 1:1600稀释后孵育1 h,单组份TMB显色液显色10min为最佳反应条件,并确定阳性阈值为029。本试验所建立的两种间接ELISA检测方法特异性好、重复性强、灵敏度高,与细胞中和试验结果总符合率可达90%和80%,可用于DHAV-3抗体的检测。