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研究背景牙周膜是一个自我更新的系统,牙周组织中存在一种原始的、可产生不同表型的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs),后将其命名为牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells, PDLSCs).自2004年被发现以来,PDLSCs即引起口腔界地极大关注,它除具有干细胞基本特性外,还具有形成骨样、牙骨质样及牙周韧带样结构组织的特性,越来越多地研究证实PDLSCs在维持牙周组织动态平衡和缺损修复中发挥关键作用。因此,PDLSCs被认为是牙周组织工程中最具有潜力的种子细胞。然而,PDLSCs的组织来源少,体外扩增极易老化,并且增殖活性和分化潜能受供体年龄和身体状况等多种因素的影响,这使PDLSCs的研究应用受到极大限制。干细胞生命活动受多种信号通路的调控,在不同的时间空间条件下,干细胞有丝分裂可能会走向老化、凋亡、分化等不同的命运。Hippo信号通路是新近发现的一种与控制器官大小和肿瘤形成有关的蛋白激酶级联通路,YAP (Yes-associated protein)是此通路中一个重要的信号蛋白,Hippo上游分子主要通过调控YAP活性从而介导不同的生物学功能。YAP在多种组织干细胞和前体细胞中均见有高表达,在维持干细胞特性、促进细胞自我更新方面发挥重要作用。已有研究表明Hippo信号通路参与小鼠牙齿发育过程,改变牙源性上皮细胞YAP的表达会导致牙齿形态发生和结构的异常,目前尚未见YAP对PDLSCs作用的相关报导与研究。此外,Hippo信号通路和与形态发生相关的TGF-β、Wnt等信号通路存在多种交叉会话,各通路之间信号传递从而组成一种高度复杂而有序地的信息网络,从而有序协调地调控细胞生长。目前关于PDLSCs的细胞生物学特性调控机制尚不十分明确。研究目的本实验拟采用小干扰RNA (Small interfering RNA, siRNA)沉默人牙周膜干细胞(Human-periodontal ligament stem cells, h-PDLSCs) YAP基因,研究YAP基因沉默对hPDLSCs增殖、凋亡及成骨向分化等生物学行为的影响。材料和方法1.原代h-PDLSCs的获取经酶解组织块法分离、有限稀释克隆法纯化、流式细胞仪分析检测细胞表面标记；扩大培养。2.设计并化学合成siRNA序列,非特异性序列一条、人YAP靶向siRNA序列三条,以脂质体LipofectamineTM2000为载体将siRNA序列转入h-PDLSCs,分别设为NC (Negative Control)、siRNA-1、2、3组,仅使用LipofectamineTM2000脂质体干预组设为空白组。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)检测转染后YAP表达水平。3.分别于转染后1、2、3、4、5天五个时间点,使用细胞增殖活性检测试剂盒(CCK-8)检测YAP-siRNA对h-PDLSCs增殖活性的影响；于转染后72h使用细胞周期检测试剂盒流式检测分析siRNA干扰后细胞周期分布,并检测YAP下游转导细胞增殖与皮间转化信号等相关的靶基因——结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF)表达水平。4.于转染后72h,使用细胞凋亡检测试剂盒通过流式细胞仪检测siRNA干扰后细胞凋亡率的变化。5.采用RT-PCR技术检测YAP-siRNA干扰后h-PDLSCs成骨相关基因(RUNX2、 OCN、ALP、Collagen Ⅰ)的表达水平。6.采用SPSS 19.0软件对数据进行处理,设P<0.05为差异有统计学意义。CTGF在这一过程中介导重要功能但需进一步验证；在YAP基因沉默后h-PDLSCs高表达成骨分化标志基因Collagen Ⅰ、ALP、OCN,其中OCN表达上调五倍,这表明YAP可能与h-PDLSCs成骨方向分化有关。因此我们认为,YAP可能在h-PDLSCs细胞生物学行为调控等方面发挥重要作用,YAP对h-PDLSCs的作用及作用机制仍需要进一步的研究。结果流式细胞仪检测细胞表达表面标记：MSCs表面标记CD73+、CD44+等(98%-99.4%),造血干细胞表面标记CD45-、HLA-DR-等。(0.28±0.012%),本实验分离培养获得细胞为h-PDLSCs;在1AP-siRNA转染后48小时,siRNA-1组、siRNA-2组与空白组和NC组相比,h-PDLSCs的YAP mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.01),且蛋白表达水平在被转染后48、72小时之间无显著差异,另外,这表明本实验设计合成的siRNA-1、siRNA-2序列可以持续特异有效地抑制YAP的表达；CCK-8增殖活性实验结果显示siRNA-1、 siRNA-2组细胞增殖活性受到明显抑制,流式细胞仪检测结果显示siRNA-/1、 siRNA-2组h-PDLSCs细胞周期也发生改变——G0/G1及S期细胞比例增多(P<0.01)、G2期细胞比例明显减少(P<0.05), YAP下游靶基因CTGF蛋白表达量也降低；流式细胞仪检测细胞凋亡率显示siRNA-/1、siRNA-2组h-PDLSCs早期及晚期凋亡率均增加；YAP-siRNA转染后h-PDLSCs成骨相关基因(Collagen Ⅰ、 ALP、OCN)的mRNA表达水平显著升高,尤以OCN最为明显。结论siRNA沉默YAP基因后h-PDLSCs增殖活性降低,细胞周期分布发生改变一一被阻滞于G0/G1及S期,h-PDLSCs凋亡率明显增加,由此可见,h-PDLSCs表达的YAP可促进h-PDLSCs增殖并抑制凋亡。此外,细胞增殖活性的改变可能与细胞周期被阻滞、细胞凋亡率增加有关,我们还推测YAP下游靶基因CTGF在这一过程中介导重要功能但需要进一步验证：在YAP基因沉默后h-PDLSCs高表达成骨分标志基因Collagen I、ALP、OCN,其中OCN表达上调五倍,这表明YAP可能与h-PDLSCs成骨方向分化有关。因此我们认为,YAP可能在h-PDLSCs细胞生物学行为调控等方面发挥重要作用,YAP对hPDLSCs的作用及作用机制仍需要进一步的研究。