前言 虹膜色素上皮(IPE)细胞与视网膜色素上皮(RPE)细胞具有相同的胚胎发育来源，基本具备RPE细胞的生理功能，且取材方便，可望代替RPE细胞实现自体移植，治疗老年性黄斑变性(ARMD)等疾病。近年来，国内外学者围绕构建光感受器复合体所需要的RPE细胞的四项生理功能进行大量研究，在IPE细胞和RPE细胞之间进行了大量的比较研究，研究表明在摄取、储存和代谢维生素A、吞噬视杆细胞外节盘膜(ROS)、分泌细胞外间质的多种细胞因子这三个方面，IPE细胞与RPE细胞有许多相似之处，可以代替RPE。但是在物质转运功能方面对RPE和IPE细胞比较研究较少。正常物质转运功能是细胞行使其它生理功能的前提与基础，在IPE细胞和RPE细胞之间进行物质转运功能的比较对IPE能否代替RPE移植具有重要意义。 在物质转运功能中，Na~+，K~+-ATPase是细胞进行物质转运的原动力，在不同的组织，其表达和分布有很大差异。RPE细胞的Na~+，K~+-ATPase分布于RPE顶端与视杆细胞外节盘膜(ROS)衔接处的微绒毛膜上密度最高，与电解质，氨基酸，葡萄糖，水等物质在视网膜和脉络膜之间的转运密切相关；IPE细胞的Na~+，K~+-ATPase分布尚未见报道。本实验中钾依赖性对硝基苯磷酸酶（K－NPPase）是 Na”，K”－ATPase中钾离于依赖性脱磷酸反应的部分，它的活性与Na“，K＼ATPase活性密切相关。 目 的 本研究采用KNPPase酶组织化学技术，对兔眼IPE细胞和 RPE细胞的 Na”，K“eTPase进行足位，利用 Metamorph图像分析系统对电镜图像中K－NPPase组化颗粒进行定量分析比较，比较IPE细胞与RPE细胞膜L Na”，K”eTPase的分布情况，为IPE细胞在物质转运方面能否代替RPE细胞行使功能提供理论依据。 材料与方法 1．实验动物：选择健康有色素家兔与无色素（白色）家兔各6只，共门只（由中国医科大学实验动物部提供人 体重2．5上对Kg，平均兔龄6个月，雌雄不限。分组设计为有色素组12只眼和无色素组12只眼；有色素组和无色素组又分别分为IPE组和 RPE组各 12例，在组与组之间进行交叉比较，最后进行总的 IPE组和 RPE组的比较。 2．标本制作：耳缘静脉注射5刀ml空气处死后，无菌操作下摘取家兔双眼球。用 4％多聚甲醛和 0．5％戊二醛混合液（含6％蔗糖）球内灌注及浸泡固定，4 OC，45分钟，将组织切成Zmm X 4mm的薄块。 3．K－NPPaSS酶组化孵 育液面制： 耿 于1＊＊工甘氨酸一＊＊HfR冲液…＊二9对川’加入主旋 ·2·咪华6刀Zing及对硝基苯磷酸加g盐p4mg，充分混匀溶解，慢慢滴入 DMSO 2．sml。 b．将构檬酸铅溶于50mmol／L 的KOH溶液中配成4刀mmol／L浓度的溶液，摇匀使之溶解。 c．将b步骤所配制的构檬酸铅一KOH溶液缓慢滴入a步骤所配制的溶液中，最终孵有液呈半透明微绿色。 4．K－NPPase酶组化孵育：将组织薄块浸入孵胄液，青于37OC温箱中，孵育40～50min。 5．电镜观察：将孵育后的组织薄块用 100mmol几 iL十肿酸缓冲液洗涤 smin；置于 1％俄酸司 二甲肿酸缓冲液中固定 30min；用 100M 二甲月酸缓冲 浪冲 洗两次，各5分钟；依次用50o刁0o七0oq0o45o刁o浓度酒精梯度脱水，各30min，再用100o丙酮浸两次，各30min；环氧树脂（Epon812浸透、包埋、聚合；切半薄切片后在光镜下定位，修块：超薄切片 700A，醋酸双氧铀电于染色 10分钟，烘干；电镜观察，主 照。 6．结果分析：采用 Metamorph／DP旧 系统分析电镜照片。随机选取IPE细胞膜上K－NPPase的阳性颗粒以及RPE细胞顶端和 ROS相接的微绒毛上的阳性颗粒相邻两点间的距离进行测量。计算每例样本的均值士标准差（无土S）①5％可信区间），通过t检验进行统计学分析，分别对有色素组和无色素组的IPE组与RPE组数据进行比较，最后再对总的IPE组和 RPE组数据进村比较。 ·3· 结 果 电镜观察：IPE细胞膜与RPE细胞顶端微绒毛膜上均可见K．NPPase颗粒沉积。 有色素组PE组与RPE组KNPPase沉积颗粒间距离经统计学比较无显著性差异，O．5＞P列二；无色素组1＊E组与RP E组KNPPase沉积颗粒间距离经统计学比较有显著性差异，＊刀刀01：有色素组与无色素组汇总后的1＊E组和RP E组广＊田防e沉积颗粒间距离经统计学比较无显著性差异，0．5＞P＞0．2。 结 论 兔眼IPE细胞膜表面与RPE细胞顶端微绒毛膜表面均有Na”，K”－ATPase分布，有色素组与无色素组汇总后的IPE组和RPE组KNPPase沉积颗粒间距离经统计学比较无显著性差异，0．5＞P＞0．2，表明用K－NPPSSe酶组化电镜观察到的IPE细胞与RPE细胞具有相似的物质转运功能。