裂谷热(Rift Valley Fever,RVF)是由裂谷热病毒(Rift Valley Fever virus,RVFV)引起的一种主要感染牛、羊、骆驼、野生动物等的人兽共患烈性传染病。RVFV可通过蚊虫叮咬、直接接触病畜及其畜产品以及气溶胶传播。人感染RVFV后出现高烧不退、呕吐、四肢无力、腹泻等临床症状。感染RVFV可致使100%怀孕母羊流产、90%羔羊死亡、20%成年羊死亡。1931年于肯尼亚裂谷首次发现RVF后,开始在非洲国家和地区流行、传播。2000年,沙特阿拉伯和也门出现RVF疫情,象征着RVF开始向非洲以外的国家和地区蔓延、扩散。2001年《禁止生物武器公约》的监控、核查名单中、2015年(8+3)和2018年(9+X)世界卫生组织(WHO)提出的优先研究疾病名单中均包括RVF。世界动物卫生组织(OIE)也将RVF规定为法定呈报传染病。随着世界经济全球化,各个国家联系密切,往来频繁,增加了 RVF自然感染或输入性病例发生的几率。我国于2016年7月确定首例人RVF输入性病例。RVF疫情的暴发流行不但威胁到人类、家畜和野生动物的健康,产生的贸易壁垒还严重影响着国家的经济贸易发展。介于传统的灭活疫苗及弱毒疫苗存在病毒毒力返强、病毒发生重组等弊端,使其在RVF非流行地区使用受到严格限制。目前,对于RVF尚无获批疫苗或特异性治疗方法。进行疫苗和治疗性抗体研发,对于预防控制RVF传播扩散、保护患者以及降低经济损失具有重要意义。从动物源头开展防控,可以有效控制RVFV的传播、扩散,研制安全性高和免疫原性强的兽用RVF疫苗迫在眉睫。为此本研究以狂犬病病毒SRV9株为载体,构建表达RVFV eGn蛋白的重组狂犬病病毒rSRV9-eGn,同时利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达RVFV Gn head蛋白与乳酸乳球菌蛋白锚钩(PA)的融合蛋白,将其展示在乳酸乳球菌肽聚糖(GEM)颗粒表面制备成RVFV细菌样颗粒RVFV-BLPs,分别进行安全性及免疫原性研究,为研制安全性高、免疫原性强的RVF新型疫苗奠定基础。1.表达RVFV eGn蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-eGn的构建与鉴定基于本实验室现有RABV弱毒SRV9株感染性克隆,本研究通过分子生物学技术将RVFV主要抗原表位Gn胞外区基因插入到SRV9基因组中,构建了包含RVFV eGn基因的重组狂犬病病毒感染性克隆rSRV9-eGn,与辅助质粒pD-N、pD-P、pD-G、pD-L共转染BSR细胞,成功拯救了重组病毒rSRV9-eGn。直接免疫荧光结果表明重组病毒rSRV9-eGn拯救成功;RT-PCR结果表明RVFV eGn基因已经成功插入到重组病毒rSRV9-eGn中且可稳定遗传;间接免疫荧光、SDS-PAGE和Western Blot结果表明RVFV eGn蛋白成功表达且与RABVG蛋白共同嵌合在病毒粒子表面,为将重组病毒rSRV9-eGn灭活使用奠定基础;电镜下观察重组病毒rSRV9-eGn具有典型的弹状形态特征;生长曲线显示重组病毒rSRV9-eGn与母本病毒rSRV9的生长动力学相似,培养72 h时为病毒的最佳收获时间;ICR乳鼠与成年鼠颅内注射不同病毒滴度的重组病毒rSRV9-eGn和母本病毒rSRV9结果表明,RVFV eGn基因的插入降低了 rSRV9毒株的神经毒性。综上所述,本部分研究成功拯救重组病毒rSRV9-eGn。2.表达RVFV eGn蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-eGn免疫原性评价为了评估重组病毒rSRV9-eGn的免疫原性,活母本病毒rSRV9与活重组病毒rSRV9-eGn单剂量免疫小鼠、灭活重组病毒rSRV9-eGn单独或辅以不同佐剂三剂量免疫小鼠。结果显示,仅灭活重组病毒rSRV9-eGn辅以Poly I:C+ISA201VG复合佐剂组可以诱导小鼠产生抗RVFV eGn特异性IgG抗体,其中以IgG1为主导亚型,IgG1/IgG2a>1表明其可触发倾向于Th2型体液免疫应答反应。利用经基于VSV系统包装的RVFV假病毒与小鼠血清进行中和抗体验证,发现含有高效价抗RVFV eGn特异性IgG抗体的小鼠血清中无抗RVFV中和抗体。取该组小鼠血清及脾细胞进行细胞因子检测发现,灭活重组病毒rSRV9-eGn辅以Poly I:C+ISA201VG复合佐剂免疫小鼠后,可诱导小鼠的Th2型细胞分泌细胞因子。除此之外,灭活重组病毒rSRV9-eGn辅以Poly I:C+ISA201VG复合佐剂还可以诱导小鼠中央型和效应型记忆T细胞数量增加。灭活重组病毒rSRV9-eGn辅以Poly I:C+ISA201VG复合佐剂免疫小鼠,可以诱导小鼠产生抗RVFV特异性IgG抗体外,还可以产生抗RABV中和抗体。RABV体内外中和实验表明一免一周、一免两周、两免一周分别有30%、70%、100%小鼠血清抗RABV中和抗体阳性;CVS-11街毒于一免一周和两免一周对免疫小鼠进行攻击,小鼠存活率分别为30%和100%。以上结果表明,rSRV9毒株具有良好的免疫原性,是一个有潜质的病毒载体。3.GEM展示RVFV细菌样颗粒的构建与鉴定基于本实验室成熟的昆虫细胞-杆状病毒表达系统,制备GEM展示RVFV细菌样颗粒。一是通过融合PCR方法将RVFV Gn head基因与乳酸乳球菌MG1363 PA基因进行融合,转染Sf9细胞进而实现RVFV Gn head-PA融合蛋白表达。将食品级乳酸乳球菌MG1363进行酸化处理,制备GEM颗粒。RVFV Gn head-PA融合蛋白与GEM颗粒相互作用,通过非共价结合方式将RVFV Gn head-PA融合蛋白展示在GEM颗粒表面。PCR扩增结果表明,HBM-His-RVFV Gn head-PA融合基因已经成功插入到重组杆状病毒基因组中;间接免疫荧光、SDS-PAGE、Western Blot结果表明,RVFV Gn head-PA融合蛋白已成功分泌性表达,但此融合蛋白只能在重组杆状病毒中传至四代,第五代细胞培养物中未检测到融合蛋白;间接免疫荧光、流式细胞术、免疫电镜结果表明,RVFV Gn head-PA融合蛋白通过非共价结合已成功展示在GEM颗粒表面。电镜下观察超薄切片结果表明,未处理的乳酸乳球菌MG1363细胞壁清晰可见、内部质地均一;GEM颗粒保留乳酸乳球菌光滑形态结构的前提下去除了其自身的遗传物质及蛋白质、内部中空;RVFV Gn head-PA融合蛋白展示在GEM表面后,GEM表面附着一层絮状物。综上所述,基于昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达的RVFV Gn head-PA融合蛋白成功地展示在GEM颗粒表面,制备成RVFV细菌样颗粒RVFV-BLPs。4.GEM展示RVFV细菌样颗粒免疫原性评价为了评估RVFV-BLPs免疫原性及不同抗原量对其免疫原性的影响,设置20μg、50μg、100 μg抗原量的RVFV-BLPs免疫小鼠。结果显示,三种抗原量RVFV-BLPs均可诱导小鼠产生抗RVFV Gn head特异性IgG抗体,但特异性IgG抗体水平与免疫原量不成正比,其中以RVFV-BLPs(50 μg)组免疫效果最佳,呈现抗体出现早、持续时间长、消退慢等特点。通过检测IgG亚型发现,三种不同抗原量RVFV-BLPs刺激小鼠产生的IgG亚型也呈现不同的特点。RVFV-BLPs(20 μg)组仅检测到IgG1;RVFV-BLPs(50μg)组检测到较高效价的IgG1,之后在免疫不同时间点检测到了 IgG2a和IgG3;RVFV-BLPs(100 μg)组仅检测到以IgG1及IgG2a,其中IgG1为主导。三种不同抗原量的RVFV-BLPs免疫小鼠后产生的IgG抗体均是以IgG1亚型为主体,IgG1/IgG2a均是大于1。取三组小鼠血清进行细胞因子分析,发现不同抗原量RVFV-BLPs免疫小鼠后,可诱导小鼠产生不同种类及量的细胞因子,表明抗原量可能强烈影响免疫过程中诱导的功能效应细胞的类型。RVFV-BLPs(20 μg)组、RVFV-BLPs(50 μg)组小鼠可产生Th1型细胞因子也产生Th2型细胞因子;RVFV-BLPs(100 μg)组小鼠以Th2型细胞因子为主。综合免疫小鼠的特异性IgG亚型及血清中细胞因子种类结果分析,RVFV-BLPs免疫小鼠后,诱导小鼠产生倾向于Th2型体液免疫应答。基于抗RVFV Gn head特异性IgG抗体结果及其血清中细胞因子分析,本研究选择RVFV-BLPs(50 μg)组进行了深入研究。利用经基于VSV系统包装的RVFV假病毒与RVFV-BLPs(50 μg)组三免两周小鼠血清进行中和抗体检测,发现中和50%RVFV假病毒的小鼠血清稀释倍数为40倍。取RVFV-BLPs(50 μg)组小鼠脾细胞进行细胞免疫检测,发现RVFV-BLPs(50 μg)可促进小鼠淋巴细胞增殖,也可促进小鼠脾细胞产生IFN-γ和IL-4细胞因子。与PBS对照组相比,CD4+和CD8+T淋巴细胞的中央记忆T细胞数量增加,主导的效应记忆T细胞减少,表明RVFV-BLPs(50 μg)免疫小鼠后,诱导小鼠产生的中央记忆T细胞定居在外周免疫器官T细胞区,当受到抗原刺激后其分化成效应细胞及效应分子,不直接发挥效应,抗原再次刺激时重新分化为效应细胞,并快速发挥免疫效应作用。综上所述,本研究中制备的两种预防RVFV感染的免疫原,即RVFV eGn蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-eGn与GEM展示RVFV细菌样颗粒RVFV-BLPs,均是首次将RABV载体与GEM展示的细菌样颗粒方法应用于新型RVF疫苗探索研究。二者特点各有不同:二者均可刺激机体产生特异性细胞免疫与体液免疫应答;灭活重组病毒rSRV9-eGn配伍佐剂使用有望研制成既可预防RABV感染又可预防RVFV感染的二联疫苗;GEM展示RVFV细菌样颗粒RVFV-BLPs易于生产、保存与运输。二者均具有开发成为RVF疫苗候选株的潜能,为RVF新型疫苗研究奠定基础。